1、ELISA,原理,方法,操作,注意事項,4,1,2,3,1,1.ELISA的原理,ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性

2、或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。,2,2.ELISA的類型,ELISA法是免疫診斷中的一項技術，現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。,3,根據試劑的來源和標本的情況以

3、及檢測的具體 條件，可設計出各種不同類型的檢測方法,用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：,雙抗體夾心法測抗原,雙抗原夾心法測抗體,間接法法測抗體,競爭法測抗體,捕獲包被法測抗體,ABS-ELISA法,競爭法測抗原,4,雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。,5,雙抗體夾心法測抗原,6,間接法測抗體 間接法測抗體主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。,7,間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用

4、粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血液中的抗E.Coli抗體發生反應?？乖幸膊荒芎信c酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白也會因竟爭吸附而影響包被效果。,8,間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性IgG 。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到

5、固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:401:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。,9,間接法測抗體,10,雙抗原夾心法測抗體 雙抗原夾心法與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。,Title in here,11,雙抗原夾心法測抗體,Title in here,

6、12,Title in here,競爭法檢測抗體 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用競爭法檢測特異性抗體。,13,競爭法測抗體,Title in here,14,競爭法測抗體,Title in here,15,競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。小分子激素 、藥物等ELISA測定多用此法。,16,競爭法測抗原,Title in here,17,捕獲包被法 在臨床檢驗中測定抗體IgM時多采用捕獲包被法。如用抗原包被的間接法直接測定 IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，

7、后者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。,Title in here,18,捕獲包被法測抗體,Title in here,19,ABS-ELISA法,ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由于一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。,20,ABS-ELISA法,Tit

8、le in here,21,3. ELISA的操作,在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進行測定。 完整的ELISA試劑盒包含以下各組分： （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （2）酶標記的抗原或抗體（結合物）； （3）酶的底物； （4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清 （定量測定中）； （5）標本的稀釋液； （6）洗滌液； （7）酶反應終止液。,22,一、加樣 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。有的測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在

9、微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。,23,（1） 標本 可用作ELISA測定的標本十分廣泛，大部分ELISA檢測均以血清為標本。血清標本按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。,24,血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中的可發生聚合，在間接法 ELISA中可使本底加深。 一般說來，在5天內測定的血清標本可放置于4， 超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清

10、融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和 ，不要在混勻器上強烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。,25,（2） 酶 ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應的轉化率高、專一性強、性質穩定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標抗體或抗原性質穩定，繼續保留著它的活性部分和催化能力。最好在受檢標本中不存在與標記酶相同的酶。另外它的相應底物應易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定，光吸收高。,26,在ELIS

11、A中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 國產ELISA試劑一般都用HRP制備結合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（ 酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵 卟啉環，在403nm波長處有最高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數）表示，是4

12、03nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ3.0。,27,（3） 酶的底物HRP的底物 HRP催化過氧化物的氧化反應，最具代表性的過氧化物為H2O2，在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O- phenylenediamine, OPD)、四甲基聯苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine, TMB)和ABTS2,2-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)。,28,OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏

13、度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物 。OPD本身難溶于水，OPD2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混 合成底物應用液后更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制 成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。,29,TMB經HRP作用后共產物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩定，可配成溶液試劑

14、，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H 2SO4終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。,30,酶反應終止液 常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。,31,二、保溫 在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為

15、例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗體結合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。,32,溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELI SA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37經1-2小時，產物的生成可達頂峰。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4更

16、為徹底，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。,33,保溫一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規 定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限

17、制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。,34,三、洗滌 洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。 通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作

18、中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。,35,（1）浸泡式a.吸干或甩干孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分 鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙 上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。,36,（2）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動

19、淋洗 ，持續沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、 快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果 更佳。,37,微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團 和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗

20、滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體溶解吸附而減低試驗的靈敏度。,38,四、顯色和比色顯色 顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。,39,OPD底物顯色一般在室溫或37反應20-30

21、分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。,40,TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應邊觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性，宜在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至 2小時后即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色

22、，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。,41,比色 比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進行比色。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規定用吸光度（ab

23、sorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角， 如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。,42,酶標比色儀 酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA結果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001，準確性為1%，重復性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對于空氣的真實A值應為1.083 0.01(1.0731.093），重復測定數次，其A

24、值均應1.0830.05（1.0781.088）在之間。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在0.0002.000，新型號的酶標儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超 出可測上限的A值常以“*”或“over”或其它符號表示。應注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為0.0002.900，而其線性范圍僅0.0002.000，這在定量ELISA中制作標準曲線時應予注意。,43,酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在1530，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果更穩定。 測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。

25、有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波 長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1，630nm為W 2，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。,44,結果判斷 定性測定 定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的簡單回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。“陽性”表示該標本在該測定系統中有反應?！瓣幮浴眲t為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其實質仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系

26、列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。 在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應的結果判斷方法不同，分述于下。,45,（1） 間接法和夾心法這類反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在ELSIA中，正常人血清反應后常可出現呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判

27、斷結果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的 指標。目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數據。先讀出標本（sample，S）、陽性對照（P）、和陰性對照（N）的吸光值，然后進行計算。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類。,46,a 陽性判定值陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數，以此作為判斷結果陽性或陰性的標準。用此法判斷結果要求實驗條件十分恒定，試劑的制備必須標準化，陽性和陰性的對照品應符合一定的規格，須配用精密的儀器，并嚴格按 規定操作。陽性判定值公式中的常數是在這特定的

28、系統中通過對大量標本的實驗檢測而得到的。現舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標明為P=92ng /ml。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均數（NCX）和陽性對照A值的平均數（PCX），兩個平均數的差（P-N）必須大于一個特定的數值（例0.400），試驗才有效。3個陰性 對照A值均應0.5NCX，并1.5NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個陰性對照重新計算NCX；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：陽性判定值=NCX+0.05標本A值

29、陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數，只適合于該特定條件下，而不是 對各種試劑均可通用。根據以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質控作用，試劑變質和操作不當均會產生試驗無效的后果。,47,b.標本/陰性對照比值在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive)，而是病人（pati ent）的縮寫，不應誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標準，現多為

30、 各種測定所沿用。實際上每一測定系統應該用實驗求出各自的S/N的閾值。更應注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質的人血 清。有的試劑盒中所設陰性對照為不含蛋白質或蛋白質含量較底的緩沖液，以致反應后產生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此 ，這類試劑盒規，如N0.05（或其他數值），則按0.05計算，否則將出現假陽性結果。,48,競爭法 在競爭法ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應中酶結合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調節陰性對照的吸光 度在1.0-1.5之間，此時反應最為敏感。 競爭法ELISA不易用自視判斷結果，因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異

31、，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。 計算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。,49,a. 陽性判定值法 與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽性對照A值，現舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為1251 00u/ml。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均值（NCX）和陽性對照A值的平均數（PCX），兩個平均數的差（N-P）必須大于一個特定的數值（例如0.300）,試驗才有效。3個陰 性對照A值均應小于2.000，而且應0.5NCX并1.5NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個陰性對照重新計算NCX；如有2個陰性對照A超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：陰性判定值=0.4NCX+0.6PCX標本A值陽性判定值的反應為陽性，A陽性判定