1、RNA提取及Q-PCR相關技術,主講：宋志新,利用含有變性劑和Rnase抑制劑的有機溶劑提取RNA，是目前常用的RNA提取方法。 Trizol（主要成分為異硫氰酸胍和酚），具有極強的裂解能力，可在短時間內裂解細胞和組織樣本，保持樣品中RNA的完整性，有效抑制RNA的降解。樣品在Total RNA Extraction Reagent中能夠充分被裂解，在加入氯仿離心后，溶液會形成上清層、中間層和有機層(鮮紅色下層)，RNA分布在上層水相中，收集上清層后，經異丙醇沉淀便可以回收得到Total RNA。提取的總RNA純度高，基本不含蛋白質及基因組DNA，提取的RNA可直接用于Northern，點雜交

2、，mRNA純化，體外翻譯，RT-PCR，以及構建cDNA文庫等各種分子生物學實驗。 Total RNA Extraction Reagent廣泛適用于培養細胞、動物組織、微生物等。 下面介紹動物組織Total RNA的提取方法,RNA提取,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,概要,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,實驗材料 1、組織（以小鼠肝臟為例） 2、RNAiso Plus（Code No: 9108）（作用同TRIzol） 3、其他：氯仿、異丙醇、75%乙醇、研缽、加樣器、1.5ml EP管、槍頭等。（均為RNase-free）,0

3、.1%DEPC水,有毒,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,準備工作 戴口罩、手套、帽子 提取區域：用75%乙醇擦拭試驗臺 試驗器具：用75%乙醇擦拭加樣槍 準備RNase-free的槍頭和離心管 低溫離心機預冷至4 準備-20預冷的75%乙醇,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的提取步驟 1、從小鼠體內取出肝臟，用預冷的生理鹽水清洗。 2、使用液氮迅速冷凍組織， -80冰箱保存。 3、使用液氮充分預冷研缽。 4、將稱重冷凍的組織（約50-100mg）從冰箱取出后迅速放入預冷好的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入

4、液氮，直至組織被研磨成粉末狀。（注：無明顯的可見顆粒，如果研磨不徹底會影響RNA的收率和質量。）,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的提取步驟 5、向研磨成粉末狀的樣品中加入1ml RNAiso Plus，并完全覆蓋樣品。（注：在加入RNAiso Plus時要保證組織沒有融化，否則RNA易被RNase降解。） 6、室溫靜置510 min。 7、待樣品融化后，用研杵繼續研磨至裂解液呈透明狀。將勻漿液轉移至1.5ml EP管中，室溫靜置5 min后，4，13000rpm離心5 min，將上清轉移至新的1.5ml EP管中。,RNA提取,概要,RT-PCR

5、,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的提取步驟 8、每1ml液體中加入1/5體積（約200l）的氯仿，蓋緊EP管，用手劇烈震蕩15秒，直至溶液充分乳化，無分相現象。（注：不能用振蕩器混勻，因為容易造成DNA和RNA的物理降解。） 9、室溫靜置5 min，4，13000rpm離心15 min。 10、從離心機中小心取出EP管，此時勻漿液分為三層，上層是透明的水層，RNA溶解在此層中；半固體狀的中間層，此層 中包含DNA；下層為粉紅色的 有機溶劑，蛋白質、多糖等物 質溶解在此層中。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的提取步驟 11、將上層水

6、相溶液小心轉移至新的EP管中，大約每個EP管中能取出400500l，謹慎操作，切勿吸到中間層。 （注：下層有機廢液勿亂丟，收集起來統一進行無毒化處理。） 12、加入等體積異丙醇，上下顛倒EP管，充分混勻。 13、室溫靜置10 min后，4，13000rpm離心10 min。可在離心后的EP管底部觀察到少量的白色沉淀。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的提取步驟 14、小心棄去上清。 15、向含有沉淀的EP管中緩緩加入1ml預冷75%乙醇，輕輕上下顛倒，清洗沉淀。（動作輕柔，無需將沉淀懸浮起來） 16、4，13000rpm離心5 min。用移液器除去

7、上清。 17、將EP管瞬時離心，用移液器仔細將殘存在EP管底部的少量液體除去。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的提取步驟 18、打開EP管，室溫放置干燥（目的是讓殘留的乙醇揮發，乙醇的殘留可能對后續的反應有影響）。干燥的時間不宜太久，RNA完全干燥后很難溶解 19、用RNase-free ddH2O溶解沉淀。（視RNA量的多少所加RNase-free ddH2O的體積從20-200不等，肝臟組織RNA產率較高，肺組織產率低） 20、RNA溶液保存在-80冰箱中。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的濃度

8、及質量檢測 1、濃度及純度檢測： （Thermo SCIENTIFIC NANODROP 1000 Spectrometer ） 核酸在260nm附近有強吸收，蛋白質在280nm附近有強吸收。所以測定溶液在260nm和280nm下的吸光度，根據A260計算提取的核酸量，根據A260/A280的比值評價提取的核酸純度。 理想的RNA純度A260/A280應在1.82.2范圍內。 低離子強度或低pH值會使OD280升高，從而使OD260/OD280值低（1.65）,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的濃度及質量檢測 2、質量檢測凝膠電泳法 利用1%的瓊脂

9、糖凝膠進行電泳，如果可以清晰觀察到兩條rRNA條帶（真核生物：28S和18S；原核生物：23S和16S），且其濃度比值大約為2:1，則RNA未降解。 若觀察到smear現象，或比值小于2:1，則RNA已發生降解。 如果觀察到大于28S或23S的條帶，則樣品可能有基因組DNA污染，這時可以考慮使用DNase I處理。,若有條帶，可能混入了基因組DNA,28S rRNA,18S rRNA,tRNA等,DL2000 DNA Marker 電泳圖（1%瓊脂糖膠，TAE）,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的濃度及質量檢測 2、質量檢測凝膠電泳法 實驗材料：

10、a. 提取的RNA溶液 b. DL2000 DNA Marker c. 6Loading Buffer d. 1%的瓊脂糖凝膠（加1l Goldview/20ml凝膠） e. 1TAE Buffer f. 電泳儀 g. UV凝膠成像儀,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的濃度及質量檢測 2、質量檢測凝膠電泳法 實驗操作： 1）取10l RNA原液至一個1.5ml EP管中，使用RNase-free ddH2O將其稀釋至200ng/l。 注：需RNase-free ddH2O體積(l)=10lRNA濃度(ng/l) /200(ng/l)-10l 2）取

11、5l RNA（200 ng/l）至一個小 EP管中，以供電泳使用。 （注：剩余部分于-80保存備RT反應用） 3）將上步的RNA 70加熱2 min。 4）冰上冷卻。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA的濃度及質量檢測 2、質量檢測凝膠電泳法 實驗操作： 5）向每管中加入1l 6Loading Buffer，混合均勻。 6）將瓊脂糖凝膠放入到電泳槽中。 7）導入1TAE Buffer，完全浸過膠面。 8）點樣：將管內樣品全部加入到一個凝膠孔里。 9）電泳：100-120V，約20-30分鐘。 10）凝膠成像。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PC

12、R,注意事項總結,RNA 提取,RNA產率估計,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,RNA 提取,RNA降解,巨噬細胞RNA,巨噬細胞RNA,動物組織RNA,逆轉錄PCR（RT-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,注意事項總結,Q-PCR,反轉錄（RT）反應 RNA自身不能作為PCR反應的模板，所以必須先將其反轉錄為cDNA。 實驗操作： 1）將提取的RNA調整濃度為500ng/l，并于70變性2min。 2）配反應體系（注意：不同的試劑盒體系不同，我們用的是TaKaRa的RR037A） 20l體系 5x Buffer 4l Oligo dT Primer 1l

13、Random 6 mers 1l DEPC H2O 1l Enzymermix 1l 提取的RNA模板 2l,逆轉錄PCR（RT-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,注意事項總結,Q-PCR,反轉錄（RT）反應 實驗操作： 1）RT-PCR程序： 37, 15min 85, 5s 4, ,反轉錄過程,使反轉錄酶失活,得到的cDNA短期可在4保存數天，長期保存應在-20以下,熒光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時在線監測整個反應進程，并結合相應的軟件對未知模板進行定量分析的方法。,熒光

14、定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,熒光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,熒光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,QPCR,雙標記探針（Taqman Probe）,熒光報告基團 （Reporter）,熒光淬滅基團 （Quencher）,序列特異性,寡核苷酸探針,游離狀態下，FRET效應，不發熒光,伴隨產物生成，熒光積累,雙標記探針（Taqman Probe）,熒光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總

15、結,QPCR,注意事項總結,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,常見問題及疑難解答 提取RNA收率低 當收率明顯低于預期時，可以考慮以下原因： 1）加入Trizol或RNAiso Plus后樣品勻漿不充分； 2）分層時水相回收率低； 3）RNA沉降后與水復溶性不好； 4）異丙醇沉降或洗滌過程中混入Rnase。,注意事項總結,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,常見問題及疑難解答 提取的RNA難以溶解 1）75%乙醇清洗沉淀后不要干燥時間過長或加熱干燥； 2）若難溶可以于60加熱5分鐘后再于冰上溶解數小時。,注意事項總結,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項總結,常見問題及疑難解答 提取的RNA降解 1）提取RNA應采用新鮮的組織材料，或者