第一篇檸檬酸發酵工藝學

第一章檸檬酸發酵簡史

一、檸檬酸發酵簡史

1.國外發展過程

1784年，舍勒從柑桔中提取檸檬酸

1860年意大利開始從果汁中添加石灰乳的方法制檸檬酸，從而進行工業化生產。

發酵法制取檸檬酸始于19世紀末

1893年，韋默爾發現青霉菌能積累檸檬酸；

1913年Zahorskl首先利用黑曲霉生產檸檬酸；

1916年，湯姆和阿里證實大多數曲霉菌都有產檸檬酸的能力，而黑曲霉產酸能力更強。

1923年美國pfizer輝瑞公司首先采用黑曲霉淺盤發酵法工業化生產檸檬酸，發酵法取代

直接提取法。

1950年前，檸檬酸采用淺盤發酵法生產；

1952年美國Miles公司在借鑒深層發酵青霉素工廠首先開發深層發酵法工業化生產檸檬

酸；

2009年世界檸檬酸產量達到150萬噸。

2.國內發展過程

1942年，湯騰漢等報道了發酵法制取檸檬酸；

1952年，陳聲等人開始用黑曲霉淺盤發酵制取檸檬酸；

1959年輕工業部完成了200L規模深層發酵制備檸檬酸試驗；

1965年原輕工業部食品發酵研究所在黑龍江和平糖廠建立了我國第一個檸檬酸生產廠，

以甜菜糖蜜為原料，淺盤發酵，鈣鹽離交提取檸檬酸，年產量100噸；

1968年上海酵母廠是我國第一家以淀粉為原料深層發酵檸檬酸投產成功；

1966年，天津工微所、上海工微所相繼開展用黑曲霉進行薯干粉原料深層發酵檸檬酸的

試驗研究，并獲成功，從而確定了中國檸檬酸的這一主要工藝路線，薯干粉深層發酵檸檬酸，

原料豐富，工藝簡單，是當時中國獨特的先進工藝；

現在人們正在大力開發固定化細胞循環生物反應器發酵技術；

2005年，檸檬酸類產品產量63萬噸，占世界總產量的44%

國內大小廠家500多個，是世界上最大的檸檬酸生產國和出口國。

第二章檸檬酸類化合物的性質

檸檬酸:又稱枸椽酸

學名：

2-羥基丙烷三竣酸

2-羥基丙烷T,2,3三竣酸

3-羥基-3-段基戊二酸

分子式C6H807

相對分子量192.13

檸檬酸是生物體主要代謝產物之一，很多水果當中都有，動物的骨骼、肌肉等也存在。在

微生物中，檸檬酸是青霉屬和毛霉屬霉菌的糖代謝產物之一。

CM.-OOOM

I

KX-OOOM

I

圖檸檬酸體形態

CK-COOX1-11s

1一無水檸掾酸2——水竹腰酸

無水檸檬酸（單斜晶系，菱形-雙菱椎體），一水檸檬酸（斜方菱晶）。

化學合成步驟

以二氯丙酮為原料

ClCH'c/QH+2HO

Cl-CH/Cl-CH/-NH.

a-CH,/OHNC-CH?OH

c上、c

/x-2HC1/、

Cl-CH/、COOHNC-CH/、COOH

HOOC-CH、/OH

+4HQ

C檸核酸

HOOC-CHJ、COOH

化學合成法工藝復雜，經濟上競爭不過微生物發酵法，發酵法的檸檬酸生產菌有曲霉、青

霉和酵母。酵母發酵能產生大量的副產物異檸檬酸，糖質原料發酵還能生成別檸檬酸。

異檸檬酸

OHCOOU

JI

HOOC-CH—CH—CH2—COOH

12345

別異檸檬酸

12345

HOOC-CH(OH>-CJi-CIX-COOH

I

coon

1.檸檬酸的物理性質

外觀與性狀：白色結晶粉末，無臭

溶解性：溶于水、乙醇、乙酸，不溶于苯，微溶于氯仿，水溶液顯酸性

它可以以無水合物或者一水合物的形式存在：檸檬酸從熱水中結晶時，生成無水合物;在

冷水中結晶則生成一水合物，慢慢加熱到70~75℃時一水合物會軟化開始熔化，至130℃完全

失去結晶水，在135~152℃范圍內完全熔化。一水合檸檬酸劇烈加熱時，在100℃開始熔化,

結塊變為無水檸檬酸，繼續加熱在153℃熔化，在15℃時，檸檬酸也可在無水乙醇中溶解。

檸檬酸結晶狀態因結晶條件不同而不同，有無水檸檬酸CH。，也有結晶水檸檬酸

C6H?也0、C6H?2H20O

檸檬酸的溶解性

檸檬酸含有羥基和竣基，故極易溶于水，溶解度隨溫度升高而增大。

在36.6℃處有一轉折點是一水檸檬酸向無水檸檬酸轉化的臨界溫度，

折點以下，溶解度曲線可以用歸49.9300+0.5303t表示

折點以上：溶解度曲線可用，W'=59.8730+2.2117(t/10)+0.03079(1710)2來表示

*

*

*

*

9

。?盤在水中的溶鯽度與41度的關系

1-W相為-冰杼依腐

2一固相為無水行健朦

表1-2擰觸在水中的溶解嶼存在形式明

砥（C）iswe（s.w/w）因相物質

10$4.0

2059.2CjHA'IItO

3064.$C|H,OT.HtO

猊6（在界點）67.3C（H1MllO+C.HG

68.8C.H.O,

50?9.9C|H|Of

6073.5C.H.O,

7076,2

8078.8

9081Je,H,a

1008d.OC.HA

2.檸檬酸的化學性質

（1）酸性與電離

。檸檬酸是一種酸性較強的有機酸，有3個H?可電離

41k1

+

。H3Ci+H20yH2。?H30

Qk2

fe+

。H2Ci?H2OHCi2?H30

k3

。HCHH2O-Ci3出0+

。9代名甘橡酸根，各級電尚常數分別為K1,K2,K3,

他們的負對數分別為pk1,pk2,pk3,

表1-3檸粽酸在水中的電虛常數

K,

溫度（P）pK,；＞K,pKf幽度cc）PpK,

03.2204.8376.393303.1164.7656.406

53.2004.8136.386353J094.7516.423

103.1764.1978.383403.0994.7006.439

153.1604.7826.384453.0974.7546.462

293.1424.7696.388503.6954*54€.484

253.1284.7616.396

一級、二級電離常數都隨溫度升高而增大，三級電離常數在0~10℃范圍隨溫度上升略有

增大，以后反而減小。

（2）加熱分解作用

檸檬酸加熱可以分解，生成多種產物，多種產物之間的關系如下圖。

（3）檸檬酸與酸反應

檸檬酸與發煙硫酸混合，在常溫下，即生成烏頭酸，稍加熱能生成3-酮基戊二酸。

發煙硫酸：S0：，的硫酸溶液揮發出來的SO3與空氣中的水蒸汽形成硫酸的細小霧滴而冒煙。

檸椽酸+發煙硫酸3*烏頭酸一*3-

酮基戊二酸

檸椽酸+濃硫酸丙酮、CO、CO2

檸核酸+濃硫酸*工烏頭酸酊

（4）檸檬酸與堿反應

檸檬酸+碳酸伴（硝酸共熔）一草酸醋酸和耳

他鹽類

檸橡酸+鈉鹽（加石灰干儲）一丙用

檸檬酸（堿溶液中煮沸）一丙烯酸\

檸檬酸的常規酸堿中水反應可生成多種鹽類。

干儲：固體或有機物在隔絕空氣條件下加熱分解的反應過程。

（5）與甘油作用

共熱產物：檸檬酸三甘油酯

如果與硬脂酸共熱，則得到合成樹脂狀物質，可作為油漆或塑料添加劑。

3.檸檬酸鈣鹽（沉淀）的性質

采用鈣鹽法提取檸檬酸，在發酵后一般先制成鈣鹽，再用硫酸酸解為檸檬酸。

檸椽酸一鈣：CaH4（C6H5O7）2

檸橡酸氫鈣：CaH（C6H5O7）3H2O

檸椽酸三鈣；Ca3（C6H5O7）4H2O

檸檬酸三鈣：工業生產中形成白色細小晶體或粉末。

含結晶水的檸檬酸鈣加熱時會失去結晶水，溫度越高，所含結晶水越少。

表1-11檸德裝纖在水中的溶解度

冷Vfawi)

再就

11T18PEOP80P

Cat<C,H?Oy)l*4H1O0.8980.850.7370.3f0

CaHgiJQO?皿。8.1655.0S54.890

￡0.760—45.17641.290

檸檬酸鈣鹽在水中的溶解度較小；并且隨溫度升高進一步降低。

如果溫度升高至95~100℃,Ca（CM01.4HQ的溶解度可進一步降低為0.578g/L水。鈣

鹽提取法就是利用這種性質。

將溶液加熱至沸，使檸檬酸鈣鹽比較完全沉淀析出，而其它有機酸鈣（葡萄糖酸鈣、草酸

鈣）等物質溶解。在溶液中含有POJ和過量Ca?-時，可促進鈣鹽沉淀。

檸檬酸鈣的溶解度也與酸度有關，pH值降低時溶解度增大。

表1-12檸凝酸鈣的溶解度與pH的關系

海解N(8/O

溶液pH

WC70P80ao90C

6.0口.4130.5650,3500.323

7.00.3800.3550.3330?2￡5

7.53.3630.3100.2900.235

4.檸檬酸其它鹽類的性質

1.鏤鹽（（NHD3c5H（NH.,）2HC5H5O7）：白色粉末，氫二鏤具有除銹、除垢作用，并且是

生產復寫紙的原料；

2.鐵鹽（FeC5H5。7?3比0）：紅色鱗片狀晶體，很好的鐵營養藥，治療缺鐵性貧血；

3.鐵鐵復鹽（Fe<NHJ3n（C5H507）.”）：紅褐色或黃褐色，治療缺鐵性貧血以及出血后貧血;

4.鉀鹽（KGHsO—HQ）：白色顆粒或結晶粉末，與酒石酸氫鈉生成結晶沉淀，用作定性；

醫藥上用作利尿劑和發汗劑；

5.鈉鹽（Na3c5H5012乩0,Na3C5H5O7?5.5H20）：醫藥上作為退熱劑、尿酸矯正劑、抗凝血劑。

食品中用作風味劑、pH緩沖劑、穩定劑和乳化劑；

6.鎂鹽（Mg3aH5。7）2?14比0）：白色鱗片狀晶體，可作為瀉藥及起泡劑；

7.秘鹽（BiCsHQ。：白色結晶粉末，醫藥上用作健胃劑和收斂劑；

8.銀鹽（Nis（CH。）2?8H20,Ni3（C5H5O7）2-14H20）：綠色晶體或粉末，具吸濕性，廣泛

用于電鍍工業；

9.鎰鹽（MnHC5HsOD：白色粉末，醫藥上作為鎰營養藥及收斂劑；

10.銅鹽（CUCHO?2.5H20）：淡綠色粉末或藍綠色結晶，醫藥上用作消毒劑，治療結膜炎、

砂眼等；

11.銀鹽（AgsCM。）：白色結晶粉末，強烈防腐劑，用于外科消毒防腐；

12.鋅鹽（Zm（C8H6。7）2?2HQ）：白色粉末，用于化工原料，生產鋅化合物；

13.專貝鹽（Ba：,（CsH。）7HQ）：白色粉末，用于化工原料，作為乳膠等涂料的穩定劑；

4.檸檬酸衍生物的性質

包括脂類、酰胺類、醛類和酸酊以及分解產物。

（1）檸檬酸三甲酯（CM。）：無色結晶，易溶于酸和醇，微溶于水。可做助燃劑、熱熔粘

合劑、發泡劑等。

（2）乙酰檸檬酸三乙酯（&凡2。8）：無色液體，高溫受熱水解，在塑料工業上用作增塑劑。

（3）檸檬酸三丁酯（G8H32。7）：無色或微黃色油狀液體，可做氣相色譜固定劑，塑料的增

塑劑。

（4）檸檬酸十八酯（C2局。）：白色或微黃色粉末，可做抗氧化劑。

（5）檸康酸、檸康酸酎（C5HQ1、C5HQ3）：有機化工原料，用于生產新型塑料。

c—c=。

■C=5OII

\0/OHOH

擰康酸酒一檸康及共聚物

5.檸檬酸的應用

在食品工業上的應用

檸檬酸也稱第一食用酸味劑，廣泛用作酸味劑、增溶劑、緩沖劑、抗氧化劑、脫腥脫臭劑、

螯合劑等。

1.飲料

飲料工業消耗的檸檬酸占檸檬酸總產量的75~80除檸檬酸是果汁天然成分之一，不僅能

賦予水果風味還有增溶、抗氧化等作用，能增加抗微生物防腐效果。

2.果醬與果凍

主要調節pH值和賦予產品酸味，在果醬中可改變風味和防止蔗糖結晶析出發砂的缺陷。

3果糖

可增加酸味并防止各種成分氧化以及蔗糖結晶析出。

4.冷凍食品

檸檬酸具有螯合及調節pH的特點，可以加強抗氧化劑的作用使酶失活，保證冷凍食品的

穩定性，還能抑制冷凍水果顏色和香氣變壞。

5.釀造酒

調節釀造酒的釀度，還可以起到抗氧化作用和保護色素作用。

6.冰激凌和酸奶

增加其口味，抗氧化性，提高產品穩定性，還能促進雙歧桿菌繁殖，促進鈣吸收

7.脂肪和油

作為抗氧化劑，并能螯合微量元素使脂肪、油和含脂肪食品不易變質，添加量

0.005%"0.02%,效果明顯。

8.腌制品

可改善風味，還可除腥氣、脫臭、抗氧化。

9.罐頭食品和水果加工

調節釀度，螯合金屬離子，保護水果所含Vc，使其不易被金屬離子破壞，減少褐變。

10.豆制品和調味品

可使大豆脫腥，也可與乳酸、琥珀酸等配合應用于醬油、醋及酵母天然調味料的調味。

檸檬酸在制藥方面的應用

1.作為泡騰片：檸檬酸與碳酸鈉或碳酸氫鈉水溶液反應，生成大量COe（泡騰）和檸檬酸

鈉，可使藥物中活性配料迅速溶解并增強味覺能力。

2.檸檬酸糖漿是發熱病人的清涼飲料，具有清涼、解毒功效。

檸檬酸普遍用于營養口服液中，維持活性配料的穩定性，加強防腐效果。

在口嚼片中，檸檬酸能改善藥片的風味。

第三章檸檬酸發酵機理

重點：檸檬酸生物合成途徑；檸檬酸生物合成的代謝調節機制。

難點：檸檬酸生物合成的代謝調節機制。

一、檸檬酸合成途徑的發現

1940年，Krebs:TCA；

1953年，Jagnnathan證實黑曲霉中存在EMP途徑所有酶；

1954年，Shu提出葡萄糖80%經EMP途徑代謝；

1954-1955年，Ramakrishman等發現黑曲霉中存在TCA循環。

1958年，McDonough發現，在形成檸檬酸的條件下，HMP途徑的酶也存在于黑曲霉中。

1.EMP途徑三個關鍵酶：

（1）葡萄糖激酶

（2）果糖-6-磷酸激酶

（3）磷酸烯醇式丙酮酸竣化酶

葡萄糖

6-磷酸葡萄糖

6-磷酸果糖

1,6-二磷酸果糖

3-磷酸甘油醛?磷酸二羥基丙酮

1,3-二磷酸甘油酸

I

3-磷酸甘油酸

2-磷酸甘油酸

磷酸烯醇式丙酮酸

丙酮酸

2.HMP途徑

表1-15累而彎三獨酸循環曲系的發現

■

陋次現唐＜年館

魏珀酸脫奧酶系Marti”（1954年）9

H星戢水合的RamakTishrnan（I951^f）B

檸檢酸合成能Rsmakrishmun&Martin（195,隼）H

舁擰糠射沒氫陵ParnakH3hmiJi&Xf.?rtin（1933年》12

丙羯限脫氫蒯RnjnakH^hmanel8］《1935年）13

乙覘輔酪A合成郵Ra-Hikrishmancta!（138隼）

a-糊皮二酸脫乳前Ramakrf^hmaijft3（1953）

富巧酸防Ru”i.tkris1inianetd《1935革）

禁采酸糧笈酶Ram^krtthinan”al（1。祐年）

軍“V物HsmakrHhnxtn.1（1955年）

3.TCA循環：檸檬酸是三竣酸循環的一個成員，19541955年研究發現了TCA循環酶系;

1954年證明存在異檸檬酸裂解酶在乙醛酸循環途徑中。

乙酰CoA輔府A

。。、。檸。檬酸。。

三裝酸循環

4-碳化介物

4.CO?固定反應

在檸檬酸生產并積累的條件下，TCA與乙醛酸循環被阻斷，不能由此提供合成檸檬酸所需

要的四碳二竣酸，必須由另外的途徑提供草酰乙酸，所以CO?固定反應對檸檬酸積累有重要的

生物學意義

（1）PEP竣激酶

（2）丙酮酸竣化酶

黑曲霉中主要為丙酮酸竣化酶，兩個系統都需要Mg”和K\

co.PEP

磷酸烯醇式丙酮酸

法激酹

H,PO4

+

草酰乙酸

二、黑曲霉檸檬酸生物合成途徑

淀上一彳-■莓?生長》tEMP/HMP.2：1

EMP1HMP產.的EMP/HMP=4：1

圖2-3-3檸櫬酸生物合成途徑

黑曲霉利用糖類發酵生成檸檬酸其生物合成途徑是，葡萄糖經EMP、HMP途徑降解生成丙

酮酸，丙酮酸一方面氧化脫竣生成乙酰CoA,另一方面經C02固定化反應生成草酰乙酸，草酰

乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。

(1)生長期與產酸期都存在EMP與HMP途徑，前者EMP:HMP=2:1,后者EMP:HMP=4：1

(2)黑曲霉檸檬酸產生菌中存在TCA循環與乙醛酸循環，在以糖質原料發酵時，當檸檬酸

積累時，TCA和乙醛酸循環被阻斷或減弱。

(3)由于TCA和乙醛酸循環被阻斷或減弱，草酰乙酸是由丙酮酸(PYR)或磷酸烯醇式丙酮

酸(PEP)竣化生成的。即由兩個C02固定化反應體系，其中以丙酮酸竣化酶作用下固定化C02

生成草酰乙酸為主。

三、乙醛酸循環與醋酸發酵檸檬酸

1958年發現，生長在標記醋酸和異檸檬酸上的黑曲霉生成了標記蘋果酸，從而證明了存

在乙醛酸循環途徑。

解脂假絲酵母能利用烷燒、乙醇、乙酸發酵生成檸檬酸。

理論上：3醋酸一1檸檬酸，在此過程沒有碳損失。

生成的檸檬酸一半轉化為異檸檬酸

酵母N源耗盡后開始烷燒發酵，低濃度AMP抑制NAD-異檸檬酸脫氫酶的活性，檸檬酸大

量合成并積累。此時順烏頭酸水合酶催化反應平衡為：檸檬酸：異檸檬酸：順烏頭酸=90：

7：3o細胞質中積累大量異檸檬酸。

圖中看出，檸檬酸向異檸檬酸的轉化和后者的裂解途徑不能時候。理想的情況應該是：轉

化的檸檬酸是生成量的1/2,并且這種循環的中間體都必須存在，因此產物和調節機制都很復

雜。產物中含有較多異檸檬酸，檸檬酸是在培養基中氮源枯竭以后開始積累的。

生產中常用單氟乙酸敏感的突變株，減弱烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶的活性來增加檸

檬酸的積累。

異檸檬酸裂解酶切割異檸檬酸產生乙醛酸和琥珀酸

CH2-COO

H—C—COO-CH?—C00-

HO—C-COO-kCH2-COO-+O=C-COO-

H.H

IsocitrateSuccinateGlyoxylate

乙醛酸經蘋果酸合成酶催化，在水的存在下接受乙酰輔酶A的乙酸，生成蘋果酸。

0C00

O=C-COO-+CH3—C'S-CoA+H20—?HO-C-H+CoA-SH+H-

HCH2

COO

GlyoxylateAcetyl-CoAMalate

四、檸檬酸生物合成的代謝調節機制

理論上推測，烏頭酸水合酶失活，TCA循環阻斷是積累檸檬酸的必要條件之一。但后來

證明生長階段此酶并未失活。進一步研究烏頭酸水合酶、NAD+和NADP+異檸檬酸脫氫酶的活

性，在供給Cu2+=0.3mg/L,Fe3+=2mg/L和pH2.0條件下，都失活，而這正是檸檬酸發酵時的

條件。

PFK是檸檬酸合成中主要調節點，正常生理條件下，能被檸檬酸抑制。

表23-15衿株■生物合威育美■的調節性最

W底物親和力融活*抑制劑

F6P：Se.)**l*7mfnol/LNH；濘驚?：K.-O.25mmoi/L

EC1AMPPEP：/?)-0.25mmol/L

PiATP(儂度較高時)

內?我激?ATP：K.-O.OSmmo</LNH；：K.=26mmol/t

EC0PEP：K.?0.024nunol/LK-K.-20nund/L

內??陵化，ADP：K.-O.OSmmol/LK*ASP：9mmol/L

ECPYP：K.-0.28nunoi/LPi：K.-40-140mmd/L

CQj：K.-1.33nund/L

ATP：KM?0.28minol/L

"合成，4ftCoA：Km>0.01mmd/LK?CoAtK(a0.2Smmol/L

EC草晟乙酸：K.-0.0045mmol/LNH；ATP-Mg：K,*?6mmol/L

異檸?殷脫皎倚異行■!酸：K.^0.01mfnol/L片犢酸：K,=0.15mmol/L

；

ECI.1.1.42NADP：KB=0.05mmol/LNADPH/O,5=0.04mmol/L

o-?戊二11

Se.jeInunol/L

城坨酸脫政摩早被乙酸：K.-O.OOinunul/L

ECI.3.99.1

檸檬酸發酵的環境條件：

磷酸鹽濃度低

NH；做N源

pH<2.0

溶氧高

Mn2\Fe\ZrT含量極低

檸檬酸發酵時，對Mn,.非常敏感，Mr?*缺乏，HMP途徑和TCA循環酶水平降低，NH；水平升

同）。

（一）糖酵解及丙酮酸代謝的調節

1、磷酸果糖激酶（PFK）：

受檸檬酸、ATP抑制

受AMP、無機磷、NH；激活

b?Vlb(悴匹林蛾跳》

EOTWIT“二■VWbbEb110?=052u,wo1\r

咐方音■事Mta-J*4nmx^\rpim

林4M期

高濃度的NH「是PFK的一種調節因子，它能解除前述檸檬酸根對PFK的抑制，NH；在細胞

內的生理濃度水平下，PFK對檸檬酸幾乎不敏感。因此Mr?+的效應是通過NH；水平升高而減弱

了檸檬酸對EMP途徑關鍵酶的抑制。

濃度對磷酸果糖激酶的影響

福■子充足和福山子缺乏下黑曲,PFK活力

因子檸修酸/(mmol/L)鐵向子/《mmol/L）活力/u

缺住4151.1

隹是131.0

Mn"缺乏菌體TCA酶活力下降！

Mn"缺乏為何會使NH4+濃度升高呢？

當培養基中缺乏時，微生物體內積累幾種氨基酸（GA、GLu、Arg等），這些氨基酸的

積累，意味著體內蛋白質的合成受阻，而外源蛋白質的分解速度則不受到影響，這樣NH；的消

耗下降，NH；濃度就會升高。

2、丙酮酸竣化酶：催化生成草酰乙酸。

底物親和力激活劑抑制劑

丙事收歿化味ADP：K?=0.05mmd/LK*ASP：K=1.9mrool/L

EC641.1PYP：K.=0?旎mmd/LPi：Ki=40~140mmoi/L

g：K8>=1.33mmol/L

ATP：Ktt?0.28mmol/L

CO?固定的酶活力高，保證草酰乙酸的供應

不被乙酰CoA抑制，a-酮戊二酸僅由微弱抑制，所以調節性很差，幾乎不受代謝產物的

調節。

3、丙酮酸脫氫酶：催化生成乙酰CoA

(二)三竣酸循環的調節

1、檸檬酸合成酶的調節：檸檬酸合成酶是TCA循環第一個酶。但黑曲霉中檸檬酸合成酶

沒有調節作用。

2、順烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶的調節：

順烏頭酸水合酶是催化檸檬酸順烏頭酸-一異檸檬酸正逆反應的酶，研究表明，黑曲

霉中有一種單純的位于線粒體上的順烏頭酸水合酶，在檸檬酸發酵中，順烏頭酸水合酶催化的

反應總是趨向檸檬酸一側，保證檸檬酸得到積累，一旦檸檬酸積累到一定水平，細胞內pH值

下降，就能抑制烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶活性。因此，它在催化時能建立下面的平衡：

檸檬酸:順烏頭酸:異檸檬酸=90:3:7。

順烏頭酸水合酶、NAD和NADP-異檸檬酸脫氫酶在檸檬酸產生與不產生時，這3種酶均存

在，而當銅離子0.3mg/L,鐵離子2mg/L和pH2.0情況下，這3種酶均不出現活力，發酵中檸

檬酸正是在這個pH條件下積累的。

順烏頭酸水合酶、異檸檬酸酶一pH2.0時，失活一阻斷TCA循環一積累檸檬酸。

順烏頭酸水合酶需要Fe,在發酵液中添加黃血鹽，絡合Fe”阻斷TCA循環，積累檸檬酸。

順烏頭酸水合酶、NA/和NADP+異檸檬酸脫氫酶在檸檬酸產生與不產生時，這3種酶均存

在，而當銅離子0.3mg/L,鐵離子2mg/L和pH2.0情況下，這3種酶均不出現活力，發酵中檸

檬酸正是在這個pH條件下積累的。

黑曲霉中依賴于NAD+的異檸檬酸脫氫酶只有一種，活性很低，依賴于NADP的異檸檬酸脫

氫酶發現了3種，在線粒體中的兩種受生理濃度下的檸檬酸抑制，所以一旦檸檬酸積累到一定

程度，就能抑制進一步分解，醋精自身的積累。

3、a-酮戊二酸脫氫酶的調節

在黑曲霉檸檬酸產生菌中，TCA循環的一個顯著特點是，a-酮戊二酸脫氫酶的合成受葡

萄糖和鏤離子的阻遏。因此當以葡萄糖為碳源時，在檸檬酸生成期，菌體內不存在a-酮戊二

酸脫氫酶或活力很低。

a-酮戊二酸脫氫酶催化的反應是TCA循環中唯一不可逆反應，一旦a-酮戊二酸脫氫酶喪

失，就會引起：①TCA循環中的蘋果酸、富馬酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循環生成，使TCA

循環成“馬蹄形"。②a-酮戊二酸又抑制異檸檬酸脫氫酶的活性。

(三)氧對檸檬酸積累的調節

氧是一個觀念上的底物，發酵過程生產的NADP重新氧化的需要。

乙酰CoA和草酰乙酸結合生成檸檬酸過程中要引進一個氧原子，因此氧也可以看作為檸檬

酸生物合成底物。它對檸檬酸發酵的作用為：

(1)氧是發酵過程生成的NADH2重新氧化的氫受體。

(2)近來的研究發現，黑曲霉中除了具有一條標準呼吸鏈以外，還有一條側系呼吸鏈。

SHAMWM

NADH

限化■不制一|

tr?aio

“色Me-能■色M?、*3

圖2-3-7黑曲毒的蚱準呼吸鏈和1M系呼吸鏈

SHAM：水楊酰異羥虧酸，產酸期，側呼吸鏈對SHAM敏感，產酸期，不敏感。

當缺氧時，只要很短時間中斷供氧，就會導致此側系呼吸鏈的不可逆失活，而導致檸檬酸

產酸急劇下降。但對菌體的生長無影響。

可以認為：NADH通過標準呼吸鏈氧化產生ATP,會抑制磷酸果糖激酶。而通過側系呼吸鏈

氧化不產生ATP。短暫缺氧會導致側系呼吸鏈不可逆失活，從而導致產酸下降而并不有害于菌

體生長。

小結：

①Mn”缺乏-＞抑制蛋白合成fNH；t,有一條呼吸活動強的不產生ATP的側呼吸鏈：解除磷

酸果糖激酶的代謝調節，促進EMP途徑暢通。

②丙酮酸竣化酶是組成型酶，不被調節控制。丙酮酸氧化脫竣生成乙酰CoA和C02的固定

兩個反應的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調節，增強了合成檸檬酸的能力。

③順烏頭酸水合酶在催化時建立了以下平衡：

檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7

同時控制Fe?-含量時，順烏頭酸酶活力降低，使檸檬酸積累。

④隨著檸檬酸積累，pH降低到一定程度時，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，更有

利于檸檬酸的積累。

(五)檸檬酸發酵的產率

1、無CO?固定反應的產率

合成1分子檸檬酸需要3分子乙酰輔酶A,也就是需要1.5分子的葡萄糖。

理論產率為：192/(180X1.5)=71.1%

2、通過CO2固定反應提供四碳二竣酸

葡萄糖生成檸檬酸的全過程中，在碳平衡方面沒有碳原子的損失，在乙酰CoA和草酰乙酸

縮合時還從水中引進一個氧原子，總反應式為：

C6H1206+l.502->C6H807+2H20

可見檸檬酸發酵對糖的理論轉化率為106.7%,以含一個結晶水的檸檬酸計為116.7%o

五、檸檬酸發酵過程的控制要點

(1)控制Mn，NHJ濃度，解除檸檬酸對PFK的抑制，使EMP暢通無阻。

(2)控制溶氧，防止側系呼吸鏈失活。

(3)控制培養基中的Fe?+的濃度，使順烏頭酸水合酶失活。

第四節檸檬酸發酵微生物

一、檸檬酸發酵生產菌種

很多微生物都能產生檸檬酸，

如黑曲霉(Asp.niger)>棒曲霉(Asp.claratus)、文氏曲霉(Asp.nentic)、泡盛曲霉

(Asp.awamori)>芬曲霉(Asp.fenicis)、淡黃曲霉(PeruciIlium,lutean)、桔青霉

(P.citrium)、二岐擬青霉(Paecilomyces梨形毛霉(Mucor.picriforoms)等。

采用不同原料所用菌種不同

淀粉原料:TD-01,初糖濃度20.8%,96h,產酸率20.24%,轉化率97.28%.

薯干原料：上海工微所f東酒2號一N-558fCo827-*T419

初糖濃度18T9%,60-90h,產酸率20.24%,轉化率97虬

糖蜜原料：川檸T7-66(四川食品研究所)，8668(黑龍江輕工所)，產酸14%,性能粗放,

抗金屬離子能力強，以甘蔗蜜糖不需要黃血鹽預處理。

*231我國檸4Mt生產用的首種(株)

原料深層液體發彝淺看液體發酵固體發解

格看川檸19-1.19-53.7-144,G23-4y-144

善干希N-558,D353,5016,3008,Co827,

GB.

木■物T419,T130.HQL-6O13

葡萄糖緡液7-130,Co827,CoM

五米(小麥)

TD-01,Co860-7

淀粉

玉米粉TD.01.Co827等

(一)黑曲霉(Asp.niger)

1.形態特征

分生抱子頭：黑色，初為球狀，后為放射狀；

分生抱子梗：大小可變，壁光滑，較厚，無抱或有淡褐色陰區。

(I)察氏瓊脂培芥基上：局限菌落，室溫(24?261)卜培養10~l4d,直徑達2.5~3.Ocm,由致

密或中度疏松的白色或微黃色窗絲組成。赭絲大部分在培養基內.著生豐富密集的直立分生抱子梗。

菌落為炭黑色，有時為深格色，反面為無色或中央呈淡黃色，有霉味，不典型，無分泌物，或局限

為微小液清，無色。有些菌株產菌棱，偶爾布滿曲落表面，球形或史球形.直徑0.8~1.2mm,初

為奶油色或米黃色，老熟時轉為禾桿黃色

(2)麥芽汁瓊脂培養要上：菌落生長較快，室溫下2周達5~6cm,平坦，密集遍布炭黑色抱干，反

面無包或微黃，無分泌物，稍有胃味，分生福子頭典型地皆生于較短的分生施子枝上，成熟時明顯

分裂成柱狀

(3)馬憐薯汁U砌糖瓊脂培養基上：前落有俑射狀溝紋，中間炭黑色，四周新生的菌絲為白色，樹

枝狀

2.生活周期

無性繁殖

抱子發芽一新抱子成熟(約50h)

4~6h開始發芽，不久即出現分枝，可育細胞為足細胞，足細胞長出分生抱子梗，分生抱

子梗頂端膨大，上面生兩層小梗，小梗上生出鏈狀抱子。黑曲霉是不斷生長延生的，抱子也不

斷地產生，直到營養枯竭為止。

圖2-34黑曲M生活周期

1-JS-F2一發芽早期3—首”迅速生長4一色足!8峋生出分生位子便5-地干1以**大

6一虛為頂衰7、8、9一初生小梗形成10一泡子形或

2.培養基

*233國外黑的“檸鼻■生產?的培養基

培界基組成生胞幡界基/(</L>發券培養翦/(g/L)

蔗需140140

琮脂200

稽酸神2.52.5

硝酸二氧件1.02.S

MfSOr7HaO0.250.25

0.0004V0.00W6

Z尸0.00380.00025

Fe2*0.00220.0013

Mn2*0.0010.001

表2-3.4國內黑曲零CO827、T419檸檄酸生產菌的培養基