摘要靈芝是我國著名藥用真菌,靈芝提取物中最關鍵的藥效成分分別為靈芝多糖及三萜，是有效的抗腫瘤物質成分，DPPH法研究靈芝液體發酵過程多糖、三萜以及發酵液的體外抗氧化能力，結果顯示：靈芝發酵過程的菌絲球大小分布較均勻，以添加麥芽糖碳源的菌絲球數量最多，麥芽糖培養基中含有98/mL個菌絲球；靈芝發酵過程的菌絲體生物量相差不大，以果糖加乳糖培養基的生物量最高，為2.54g/L；靈芝發酵過程的胞外多糖含量以果糖加乳糖培養基含量最高，為0.47g/L；靈芝發酵過程的胞內多糖含量以乳糖培養基的含量最高，為2.66g/L；靈芝發酵過程的三萜含量以葡萄糖培養基最高，為0.32%；靈芝發酵過程的DPPH抗氧化性以乳糖加蔗糖培養基含量最高，為17.23%。本文可為靈芝經濟有效的液體發酵提供理論參考。關鍵詞：靈芝；液體發酵；多糖；三萜；菌絲體生物量。AbstractGanodermalucidumisafamousmedicinalfungusinChina.ThemostimportantpharmacodynamiccomponentsofG.lucidumextractareGanodermalucidumpolysaccharideandtriterpenes,whichareeffectiveanti-tumorcomponents.DPPHmethodwasusedtostudytheantioxidantabilityofpolysaccharides,triterpenesandfermentationbrothduringliquidfermentationofG.lucidum.Asaresult,thenumberofmycelialspheresinthefermentationprocessofG.lucidumwasthemost,and98/mLmycelialspheres.thebiomassofthebasewastheheaviest,2.54g/L;theextracellularpolysaccharidecontentinganodermalucidumfermentationprocesswasthehighestinfructoseandlactosemedium,0.47g/L;theintracellularpolysaccharidecontentinG.lucidumfermentationprocesswasthehighestinlactosemedium,2.66g/L;thetriterpenoidcontentinganodermafermentationprocesswasthehighestinglucosemedium,0.32%;theDPPHantioxidantcontentinthefermentationprocesswasthehighestinlactoseplussucrosemedium,17.23%.ThispapercanprovideatheoreticalreferencefortheeconomicalandeffectiveliquidfermentationofG.lucidum.Keywords:Ganodermalucidum;liquidfermentation;polysaccharide;triterpene;myceliumbiomass目錄TOC\o"1-3"\h\u1引言 碳源對靈芝深層發酵菌絲形態、多糖及三萜合成的影響研究1引言1.1靈芝概況靈芝（Ganodermalucidum）一種食藥兩用真菌。其本身有很高的藥用價值，也可以食用。由于靈芝為高溫性菌，而且需要較高濕度，其主要分布在我國南方，如浙江、福建、廣東等地。靈芝雖然分布廣，但野生靈芝及其稀少[1]，現在大部分靈芝都是人工培養。從古至今靈芝都在各種醫學寶典出現，由此看出其醫學價值，因此有著“仙草”之稱。靈芝在我國民間作為藥材延年益壽已有兩千多年歷史。靈芝子實體主要成分有三萜類、靈芝多糖、活性肽及多種氨基酸等生物活性物質。對冠心病、糖尿病、神經衰弱、延緩衰老等疾病有一定的療效，還具有抗癲癇、治療糖尿病等藥理作用。1.2靈芝的主要成分1.2.1三萜類三萜是靈芝有效的化學成分之一，不僅具有抗腫瘤、抗HIV‐1及HIV‐1蛋白酶活性、抗組織胺釋放、抗微生物等多種治療作用，而且還具有降血糖、降血脂等多種治療作用。目前，已知能獲取三萜材料的方式有三類，第一類是野外或人工栽培的子實體，主要以人工栽培為主，野外子實體較難獲得；第二類是靈芝孢子；第三類是液體發酵菌絲體和發酵液，這是目前較為常采用的方法。馬林等采用HPLC測定靈芝子實體、孢子粉、菌絲體中LucidenicacidA、ganodericacid

A、ganodericacidB和ganodericacidC的含量，發現靈芝子實體中4種三萜酸含量均高于靈芝孢子粉，此法有高效快捷等優點，適用于靈芝及相關制劑的三萜類物質檢查和含量測定[2]。1.2.2多糖類靈芝多糖在藥理學中具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗衰老、抗菌等[3-5]多種功效。毒理學臨床實驗中也證明靈芝多糖的生物活性組分廣泛，是生命活動的物質之一[6]，有利于人體健康，無副作用[7]。目前，研究人員對靈芝多糖的分離、純化、結構進行了廣泛研究，相關產品越來越多。至今仍然是國內外關注的課題[8]。1.2.3核苷類隨著研究深入，多種物質被確認是靈芝主要活性成分，如多糖、三萜類以及核苷類[9-10]。研究顯示靈芝核苷類對人體有著很大作用，其可以作用于嘌呤受體，讓其起到多種生理作用[11-12]。可采用薄層色譜對其進行鑒別，總核苷含量可以用紫外分光光度法測定。1.2.4氨基酸類靈芝子實體由18種氨基酸組成，人體必需氨基酸的含量最高，比一般食用菌高40%[13]，靈芝中的氨基酸不但是體內代謝和合成的基礎物質，而且藥用價值很高。1.3靈芝的藥理作用1.3.1治療糖尿病糖尿病是由多種原因引起的全身系統代謝功能障礙的慢性疾病，其一系列的并發癥對患者生活質量造成嚴重影響，甚至可能對其生命構成威脅。因此，糖尿病治療及輔助治療藥物的研發成為近年來國內外學者關注的熱點?，F代藥理研究表明，靈芝多糖降血糖作用靶點多且效果顯著[14]。糖尿病大鼠以鏈脲佐菌素誘導的Ⅱ型為模型，研究闡明，靈芝多糖能顯著改善Ⅱ型糖尿病，能夠降血糖和降血脂，可能與糖脂代謝密切相關[15]。1.3.2保護肝臟肝損傷是世界公認的無法完全治愈的流行性疾病之一，其極有可能會進一步惡化發展成為肝癌[16]，因此，在臨床研究靈芝多糖對保護肝損傷具有重大意義。研究靈芝多糖對抗炎、保肝的作用機制，致急性肝損傷以四氯化碳（CCl4）小鼠為對象，實驗闡明抑制一氧化氮合酶（iNOS）的活性和促炎因子TNF-α的形成、阻止核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）的活化來實現[17-18]，其保肝作用機制可能與保護細胞膜結構完整性、抗自由基脂質過氧化、顯著降低天冬氨酸轉氨酶（AST）和血清丙氨酸轉氨酶（ALT）水平等有關。馮嫣[19]研究表明，靈芝多糖可明顯改善二乙基亞硝胺（DEN）致肝組織細胞病理變化所誘導的小鼠肝損傷。Yu等[20]研究表明，靈芝多糖可通過上調Bcl-2/Bax比值和Bcl-2的表達、下調Bax的表達來預防小鼠過量運動后的肝細胞死亡。因此，保肝作用是由靈芝多糖通過保護細胞膜結構完整性、抗自由基脂質過氧化、提高肝臟抗氧化能力等途徑。1.3.3抗癲癇 患者的生活質量嚴重被癲癇反復發作所困擾，因此，加強有效物質的篩選對治療癲癇的效果尤為重要。朱孔利等[21-22]研究說明，癲癇模型大鼠腦組織中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK14）的表達水平能被靈芝多糖顯著降下，能夠增強鈣調神經磷酸酶（CaN）和GSH-Px的活性，控制癲癇的發作。上述作用可能與靈芝多糖升高谷氨酸轉運體：GLT-1（EAAT2）、GLAST（EAAT1）等的表達延長癲癇發作時間和降低神經細胞興奮性有關[23]。1.3.4內分泌與代謝系統主要體現在降血糖、保護肝臟和解肝臟毒等方面。小鼠腹腔注射赤芝多糖能促進血清、肝臟及骨髓的蛋白質與核酸的合成，增加肝勻漿細胞P450的含量，提高肝臟的解毒功能[24]。1.3.5呼吸系統靈芝具有止咳祛痰，解痙平喘的作用。研究發現，在腹腔注射靈芝發酵液有一定止咳作用，其作用是讓引咳期變長，也可降低咳嗽頻率[25]。靈芝中提取的赤芝酊、菌絲體醇不但可以使組胺引起的離體豚鼠氣管平滑肌收縮有解痙作用，還可以解決大部分動物“哮喘”問題，雖然不能根除，但可使潛伏期變長。隨著不斷深入，還發現靈芝對過敏有著一定作用，它可以使過敏慢反應物質及組胺釋放。1.4靈芝人工栽培靈芝長久以來都是通過人工栽培或者野外采集獲得的。樹樁栽培和代料栽培是傳統人工栽培靈芝子實體的主要方法[26]。在樹樁上接上靈芝菌絲進行培養是樹樁栽培方法，因此利用闊葉的枯木、倒木代替原木。代料栽培是采用農作物進行代料，其中棉籽殼和木屑為主，且產量高，菌絲生長速度快，還能減少對環境的破壞，但是生產出的靈芝子實體產量高，個體較小[27-28]。代料栽培主要是室內栽培，主要利用玻璃瓶或者用無毒的塑料袋的栽培方式。人工栽培靈芝子實體的優點有設備投資少、工藝簡單等優點，但需大量木材，易浪費資源，且栽培時間長[29]。不適合于大規模工業化生產，導致培養成本增加，靈芝價格昂貴。相對靈芝液態發酵培養而言，原料來源廣泛、生產進程容易控制、生產時間短等優點，因此，液態深層培養發酵是一種具有極大潛力的方法。1.5研究意義隨著液體深層發酵技術的發展,到目前為止，近代工業化食品、藥品以及大型真菌已大規模采用深層培養方法。子實體中不僅有靈芝多糖的存在，多糖的主要成分是來源于靈芝液體深層發酵獲得的菌絲體，發酵液富含藥用價值活性成分，經過提煉和進一步加工可制成食品添加劑和保健食品，且培養原料來源廣、成本低廉、生產周期短、產物高產、能更好的在工廠化中生產[30]。目前已是生物發酵工程的一種新興產業，市場前景廣闊，具有很大的優勢。本實驗可為靈芝在保健食品、食品添加劑、工業化液體深層發酵技術等方面提供參考。1.6研究內容本文研究碳源對靈芝發酵過程菌絲形態、菌球、多糖以及三萜合成的影響，并對發酵液的營養成分進行分析。2材料與方法2.1材料2.1.1試供菌株靈芝菌種：靈芝NA34，保存于寧德師范學院生命科學學院發酵工程實驗室。2.1.2主要試劑藥品苯酚、高氯酸、硫酸、濃硫酸、95%乙醇、香草醛-冰醋酸、氫氧化鈉、蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、蛋白胨、酵母粉、土豆、瓊脂、DPPH溶液。2.1.3主要儀器設備儀器名稱型號生產廠家恒溫搖床NRY-200上海南榮實驗室設備有限公司垂直新穎雙人單面凈化工作臺SW-CJ-2D蘇州凈化設備有限公司新世紀紫外可見分光光度計T6北京普析通用儀器有限公司鼓風干燥箱DHG-9070A上海飛越實驗儀器有限公司電熱恒溫培養箱DHP-9272A上海飛越實驗儀器有限公司電子天平YP802N上海精密科學儀器有限公司自動壓力蒸汽滅菌鍋GR85DR致微（廈門）儀器有限公司2.2方法2.2.1培養基配制半合成培養基：蛋白胨5g/L、葡萄糖40g/L、硫酸鎂0.5g/L、磷酸二氫鉀1g/L、酵母粉4g/L。 PDA培養基：馬鈴薯200g/L、瓊脂20g/L葡萄糖20g/L。多糖發酵培養基（1L）：名稱葡萄糖（g）果糖（g）麥芽糖（g）乳糖（g）蔗糖（g）硫酸鎂（g）磷酸二氫鉀（g）蛋白胨（g）酵母粉（g）1400.51542--400.51543400.5154440--0.51545400.5154620200.5154720--200.515482020--0.5154920200.515410--20200.515411--20--20--0.515412--20200.5154132020--0.51541420--200.51541520200.51542.2.2菌種活化將土豆煮熟，取汁，加入葡萄糖和瓊脂，完全溶解后裝入試管三分之一處，121℃下高溫滅菌20min，滅菌結束后取出倒斜面，將靈芝菌絲塊接種母種斜面培養基上,放置電熱恒溫培養箱中，25℃下培養5d。2.2.3接種與培養培養基80mL裝入250mL搖瓶，121℃下高溫滅菌20min。超凈工作臺上，將活化菌種搗碎菌塊5至6塊接入，恒溫搖床27℃、160r/min振蕩培養，培養4d后，用移液槍吸取10mL菌絲球，再重新接入半合成培養基，置恒溫搖床27℃、160r/min振蕩培養，培養2d，再吸取5mL轉接后的菌絲球到15種糖的液體培養基中，恒溫搖床27℃、160r/min振蕩培養，培養4d。2.3測定方法2.3.1菌絲球數量測定將培養好的發酵液，吸取2mL于培養皿中，分別數出0.5mm、1mm、2mm、3mm的菌絲球數量。2.3.2生物量測定采用紗布過濾，用ddH2O清洗菌絲，收集菌絲體，放至干燥箱60℃恒重，精準稱量。2.3.3胞外多糖含量測定吸取1mL發酵液，加入4mL95％酒精，至4℃冰箱隔夜，（8000r/min離心15min）棄上清，加3mLddH2O，搖勻，接著取0.3mL樣品，加0.7mLddH2O、0.5mL5％苯酚，混合，再加2.5mL濃硫酸，混合，將發酵液置沸水浴中15min，降溫，用分光光度計測定，標準曲線計算。2.3.4胞內多糖含量測定稱取干重菌絲體0.1g，加1moL氫氧化鈉1mL搖勻，60℃水浴加熱1h，取0.2mL，加0.8mLddH2O，再加0.5mL5％苯酚，混合，再加2.5mL硫酸，混合，做對照，置沸水中15min，冷卻，用分光光度計測定，根據標準曲線計算。2.3.5三萜含量測定稱取干重后菌絲體0.1g，加2.5mL95％乙醇，30℃搖床3h，再取0.2mL，水浴60℃干燥，再加0.8mL高氯酸溶液和0.5mL香草醛-冰醋酸溶液，搖勻，水浴60℃15min后，降溫，最后加冰醋酸溶液2mL，靜置，以乙醇蒸干的作為對照，用分光光度儀測吸光度值，根據標準曲線計算。2.3.6抗氧化活性測定準確稱取0.039gDPPH固體，加100mL95％乙醇,混勻，4℃冰箱保存備用。吸取1mL發酵液，加入4mL95%乙醇，4℃冰箱過夜，8000r/min離心5min，棄上清，留沉淀，加3mLddH2O，振蕩混勻，再取樣品，加2mlDPPH，靜置30min,做對照組，用分光光度計測定，標準曲線計算。3結果與分析3.1菌絲球大小及數量在靈芝發酵過程的變化在15種培養基中菌絲球大小及數量的變化見表3-1所示，可看出0.5mm菌絲球大小變化最小，最穩定，均保持在20個以內；其次是3mm菌絲球，變化略高于0.5mm菌絲球；2mm菌絲球大小變化較大，最大與最小之間存在較大差值；而1mm菌絲球大小改變量最不穩定，差值最大，如麥芽糖加蔗糖培養基菌絲球數量最多，葡萄糖加麥芽糖培養基菌絲球數量最少。表3-1菌絲球在靈芝發酵培養基的變化3mm（個）2mm（個）1mm（個）0.5mm（個）總數（個）葡萄糖205910710196果糖10561199194麥芽糖1278855180乳糖1270904176蔗糖1161963171葡萄糖+果糖301002910169葡萄糖+麥芽萄糖+乳糖16696315163葡萄糖+蔗糖+麥麥芽糖23625413152果糖+乳糖2267526147果糖+蔗糖2171384134麥芽糖+乳糖1077432132麥芽糖+蔗糖8654017130乳糖+蔗糖10683561193.2生物量在靈芝發酵液培養基的變化圖3-1所示，菌絲體生物量在靈芝發酵液培養基的變化，可看出培養后，靈芝發酵生物量樣品組與對照生長趨勢無明顯變化，但對照組的菌絲體生物量穩定性高于樣品組的菌絲體生物量。圖3-1生物量在培養基發酵的變化3.3胞外多糖含量在發酵培養基的變化圖3-2可看出添加不同碳源的培養基，發酵液多糖含量相近，但對照組略高于樣品組，以添加乳糖加蔗糖的培養基，其胞外多糖含量最低。圖3-2胞外多糖含量在靈芝發酵培養基的變化3.4不同碳源培養基菌絲胞內多糖含量不同碳源培養基菌絲體中胞內多糖見圖3-3所示，不同碳源的培養基，菌絲多糖含量變異大，其中以乳糖培養基胞內多糖含量最高，葡萄糖加乳糖培養基的胞內多糖含量最低。圖3-3胞內多糖含量在靈芝發酵培養基的變化3.5不同培養基中靈芝菌絲體的三萜含量不同碳源培養基中靈芝菌絲體的三萜含量如圖3-4所示，看出發酵過程菌絲三萜的含量相近，以麥芽糖培養基的三萜含量最低，果糖培養基的三萜含量最高。圖3-4三萜含量在靈芝發酵不同培養基的變化3.6不同碳源培養基菌絲體多糖的DPPH抗氧化性不同碳源培養基菌絲體多糖的DPPH抗氧化性見圖3-5所示，可看出DPPH均在麥芽糖加蔗糖培養基最低，但兩者最大處不同，前者最大在葡萄糖培養基，后者則在果糖培養基。兩者變化接近。圖3-5DPPH抗氧化性在靈芝發酵的變化4討論靈芝液體深層發酵技術，在某些局部性降低采收野生靈芝和人工栽培，此方法成了國內外關注的焦點，當前，靈芝液體發酵研究大多集中在優化培養條件、選育優良菌株、改良發酵工藝和篩選發酵培養基等，極大提高液體發酵收集靈芝菌絲的技術水平。盡管如此，還依然存在著問題：如靈芝發酵過程的菌絲形態的多變性，其又對發酵液粘度以及傳質產生影響；此外，大多數發酵利用添加有大量金屬離子如Mg2+等以及其它不可食用成分，發酵結束后發酵液難于有效利用，不宜應用于食品及保健品的研究。目前，人們對靈芝有益效化學成分的不斷深入探索，不僅僅是靈芝對某些疾病和保健功效的研究，而是將靈芝的防病功能為主要對象，靈芝的產品不僅僅也只是應用于食品和藥用，還更深入了飲料行業等。因此，人們對于靈芝栽培的方法還應不斷擴增，也需進一步改技術，深層培養發酵和工藝提取還需要進一步的改進。等靈芝的產量充足后，以后我們深入研究靈芝的化學及藥理成分，并尋找具有藥用作用的物質基礎，開發靈芝新劑型創造更多的價值，降低靈芝價格，推動市場前景，為人類服務。靈芝有著非常廣泛的用途尤其對抗腫瘤方面有著一定的作用，這使得人們對它投以更多的關注，隨著社會飛速發展和醫療水平不斷提升，利用靈芝對病情預防以及治療有著非常好的前景，相信在不久的將來，靈芝對臨床的應用會有不可估量的突破，會為人類的健康提供更大的幫助。參考文獻[1]張貴君主編.中藥鑒定學[M].科學出版社,2002[2]林忠平，林志彬.靈芝[M].2版.北京科學出版社，1985：1,79.[3]LINZB.Cellularandmolecularmechanismsofimmuno-modulationbyGanodermalucidum[J].JournalofPharma-ceuticalSciences，2005，99（2）：144-153.[4]LIUZG，XINJ，ZHENGSS，etal.GanodermalucidumpolysaccharidesencapsulatedinliposomeasanadjuvanttopromoteTh1-biasimmuneresponse[J].CarbohydratePolymers，2016，142：141-148.[5]LüXC，CHEND，YANLC，etal.Comparativestudiesontheimmunoregulatoryeffectsofthreepolysaccharidesusinghighcontentimagingsystem[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules，2016，86：28-42.[6]何慧，謝筆鈞，呂玉華，等.發酵靈芝粉中肽類化合物的分離

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論文的綜合研究法介紹1.什么是綜合研究法所謂綜合研究法就是綜合運用相關學科知識進行研究的方法。姜亮夫說："最近，我寫《楚辭通故自序》說到了一-些治學方法，我綜合了一切社會科學來寫'屈原賦，頗有游刃自如之樂。綜合研究，不正是現代科學成就的主要方法嗎？社會科學也得綜合研究。"其實我們寫學術論文，哪怕是分析一首詩，往往都需要采用綜合研究的方法。譬如唐人張繼的《楓橋夜泊》，此詩的詩題與詩句均有異文，這就涉及文獻學知識。此詩中的"烏"與"江楓"作何解釋，這就涉及語言學乃至生物學知識。此詩中的"楓橋""寒山寺"等地名，顯然涉及地理學知識。此詩之所以成為寫愁的代表作，顯然與作者生平和時代背景密切相關，這就涉及史學知識。這首詩好在什么地方，要說出個道理來，顯然需要掌握文藝理論知識。[6991所以我們在寫學術論