第二章生產中常用菌種的分離、選育和保藏

第一節菌種的分離篩選第二節培養分離第三節工業微生物育種第四節菌種的保藏及活化帶圖象分析系統的微生物菌種

顯微觀察裝置

第一節菌種的分離簡介

一、菌種的來源根據資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。二、分離思路

新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。有了優良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設備與之配合。定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養分或培養條件，使所需菌種增殖培養后，在數量上占優勢。分離：利用分離技術得到純種。發酵性能測定：進行生產性能測定。這些特性包括形態、培養特征、營養要求、生理生化特性、發酵周期、產品品種和產量、耐受最高溫度、生長和發酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟菌種篩選主要步驟調查研究及查閱充分的資料

↓

設計實驗方案

↓確定采集樣品的生態環境

采樣

↓確定特定的增殖條件

增殖培養

↓確定特殊的選擇培養基及可能的

↓定性或半定量快速檢出法

平板分離

↓

原種斜面

↓確定發酵培養基礎條件

篩選

↓

初篩（1株1瓶）

↓

復篩（1株3～5瓶）

↓結合初步工藝條件摸索

再復篩（1株3～5瓶）

↓

3～5株

↓

單株純種分離

↓生產性能試驗

↓→毒性試驗

菌種鑒定（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區和果園內。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。從自然界篩選2、采樣季節：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當地點后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。（二）增殖培養為了容易分離到所需的菌種，讓無關的微生物至少是在數量上不要增加，可以通過配制選擇性培養基，選擇一定的培養條件來控制。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。（三）培養分離

盡管通過增殖培養效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養的選擇性控制條件還應進一步應用，而且控制得細一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。1.稀釋平皿分離法1.稀釋平皿分離法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋1.稀釋平皿分離法b.涂布平皿分離法a.傾注平皿分離法2.平皿劃線分離法

a.連續劃線分離法b.分區劃線分離法（四）篩選這一步是采用與生產相近的培養基和培養條件，通過三角瓶的容量進行小型發酵試驗，以求得適合于工業生產用菌種。（五）毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產毒的，將其作為生產菌種應當十分當心，尤其與食品工業有關的菌種，更應慎重。據有的國家規定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。第二節培養分離從自然界中分離培養微生物是菌種選育的重要和基礎的步驟。到目前為止，還沒有一種分離培養方法能揭示一個試樣中所包含的所有微生物總數和種類。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數特定種類的菌株；在工業微生物篩選過程中，應及時調整檢測方法，以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應。因此，建立一更為科學的和針對性不強的分離方法是必要的。一、成功的分離培養方法(1)認真考它所需產品的特征和生產過程；(2)制訂初步的篩選標準；(3)將生態學方法運用到分離和篩選過程。三、將生態學方法用于培養分離的一般思路要點1．羅列出所要分離的微生物類群；2．根據所采集樣本的各種生態參數，描述所要分離的微生物之生態系統或棲息地：3．將若干樣本分成若干類型，如植物和植物各部，土壤(類型和土層)、巖石、水、昆蟲和發酵食品等；4．羅列出所要考察和測量的環境參數，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢及溫度等；

5．列出生物系統中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質、葡萄表皮的果膠；

6．根據上述1-5項中所獲得的數據，設計分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養條件；

7．用標準方法作對照來評價生態學分離方法；

8．根據待檢材料的生態參數需要，修改已知的方法；

9．運用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。四、自然界中細菌的分離

(一)采樣和采集方法為了從一特定生態系統中分離出具有代表性的細菌菌群，特別是分離那些在唯一微環境區域中出現的菌群時，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。采樣的注意事項1、采樣時應盡可能保持相對無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態參數等；4、應充分考慮采樣的季節性和時間因素，因為真正的原地菌群的出現可能是短暫的；5、采好的樣應及時處理，暫不能處理的也應貯存于4℃下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態環境，其內部生態環境就會發生變化，微生物群體之間就會出現消長(二)生態學參數及培養基

的組成原則1、加入培養基中的天然提取物種類和用量、環境生物物理學參數以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會影響實驗中所要分離的細菌的數量和種類。2、就分離培養基的組成而言，部分培養基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養基中的天然提取物，部分培養基中則應含有多種碳、氮源，如幾丁質、纖維素或果膠。3、所有分離培養基中都應含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50μg／m1，以抑制真菌的生長。4、瓊脂平板在使用前應置于37℃培養箱中孵育l、2天。5、培養基的生物物理學參數，如pH及鹽分也應調節到與試樣的生態系統參數值相近。二、分離目的微生物不純，需分離純化。采用簡便迅速，有一定準確性的檢出方法，提高篩選效率。常用平皿反應法：紙片培養顯色法：浸有指示劑濾紙。透明圈法：混濁底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸鈣等。

變色圈法：直接用顯色劑或指示劑。

生長圈法：利用某些具有特殊營養要求的微生物作為工具菌，要分離的微生物能在一般培養條件下生長而合成該營養物而使工具菌能生長，形成生長圈。

抑制圈法：瓊脂塊培養法。用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株

羧甲基纖維素鈉作培養物抗生素篩選檢定菌培養，加上發酵液五、放線菌的分離培養基的組成原則大多數放線菌的分離培養是在貧脊或復雜底物的瓊脂平板上進行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養4-20天內在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應在37℃培養箱中存放3天。放線菌的分離土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細菌數量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養。也可洗下微生物后振蕩培養。水中放線菌的分離：為使所要分離的放線菌的數量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進行系列稀釋和涂布。次代培養及純化菌落形成后可根據肉眼可見的菌落形態上的差異，作初步的鑒定和區分。通過高倍放大進行鏡檢，可了解氣生和營養孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養基；而肉眼識別不同的生長形態、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進行影印培養，以進一步篩選和分離。放線菌菌落形態六、真菌分離1、利用低碳／氮比的培養基可使真菌生長菌落分散，利于計數，分離和鑒定。這里主要是利用營養成分的減少而使生長減慢，并由此限制真菌的遷徙生長。2、改變培養溫度將有利于不同嗜溫區真菌的分離。3、有時，真菌子實體形成必須有光線，這在分離培養時應加以考慮。4、選擇性富集：是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數量上的增加而利于分離的一種技術。富集可以是種水平的，如通過營養要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、在分離培養基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細菌生長及菌落形成。真菌的分離方法土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過篩法，庶糖密度梯度離心法。植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。餌誘技術常用于水中真菌的富集。子實體直接分離培養擔子菌：新采集的子實體組織植入平板內或在放于液體培養基表面放一小塊無菌濾紙上培養。七、生產選種是在長年累月的生產實踐中，在培養工藝條件沒有任何可見變更情況下，突然發現某些批次生產水平提高較大，這就有可能是個別自然變異朝更好的方向變的細胞，在這種條件下很適應于培養條件，并逐漸顯示出它的生長優勢，這種優勢的發展，促使它優良的生產性能表露。第四節工業菌種的育種方針工業菌種的育種：是運用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現存的優良性狀強化，或去除不良性質或增加新的性狀。工業菌種育種的方法誘變基因轉移基因重組育種過程包括下列3個步驟：

(1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評價(包括實驗規模和工業生產規模)。選擇育種方法時綜合考慮的因素

(1)待改良性狀的本質及與發酵工藝的關系(如批式或連續發酵試驗)；

(2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學萬面認識的明了程度；

(3)經濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術：如果對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。工業菌種改良方法

(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數或增加相應基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。

(2)增加前體物的濃度。

(3)改變代謝途徑，減少無用副產品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產品的耐受力。(4)抑制或消除產品分解酶。(5)改進菌種外泌產品的能力。(6)消除代謝產品的反饋抑制。如誘導代謝產品的結構類似物抗性。

提高特定基因的表達水平(1)引入強轉錄及翻譯信號，可通過在一高效表達載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修改現有表達信號，提高基因效力等。(2)誘導解除基因表達抑制的突變。

改進菌種的生長效率提高菌株對底物的利用率方法：

a.通過確定并改變代謝中的耗能部分;b.由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實現。

c.賦予菌種對多種底物，特別是價廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費用。第四節誘變育種以微生物的自然變異作為基礎的生產選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發突變為基礎的育種，是迄今為止國內外提高菌種產量、性能的主要手段。誘變物理、化學或生物誘變方法

一、誘變劑和誘變處理物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質的，有一定的穿透力，一般都由專業人員在專門的設備中使用，否則有一定危險性。超凈工作臺小型X射線衍射儀Co60射線機化學誘變劑：化學因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等。化學誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學誘變劑的優缺點：1、大多數情況下，就突變數量而言，要比電離輻射更有效。2、化學誘變劑是很經濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射±行工作時，設備費用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當心。誘變劑的選擇1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。二、誘變育種步驟出發菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養分離和篩選(一)出發菌株的選擇1．自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。2．在生產中經生產選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發菌株留作繼續誘變。

5．要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產基因。

6．根據采用的誘變劑或根據細胞生理狀態或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處理會使細胞產生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養細胞，就要選對數期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。

(二)處理菌懸液的制備這一步驟的關鍵是制備單細胞和單孢子狀態的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養基的培養，并要離心，洗滌，過濾。帶玻璃珠的三角瓶內,加無菌水(三)誘變處理根據前面有關誘變劑及誘變處理的介紹，結合誘變對象的實際，設計誘變處理方案。

(四)中間培養由于在發生了突變尚未表現出來之前，有一個表現延遲的過程，即細胞內原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現出來。此過程稱為中間培養這個過程對今后的篩選和獲得穩定菌株都是極為重要的。方法：讓變異處理后細胞在液體培養基中培養幾小時，以讓細胞的遺傳物質復制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。若不經液體培養基的中間培養，直接在平皿上分離就會出現變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果的不穩定和將來的菌株退化。(五)分離和篩選篩選分初篩和復篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復篩則是精選，以質為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.

初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產物與某些染料或基質的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者，而將90%的菌落淘汰。在數量減少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株，最后才能選得優秀菌株。在以后的復篩階段，還應不斷結合自然分離，純化菌株。搖床復篩降解纖維素產生產透明圈病毒產生產空斑紫外線的誘變育種

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。

被照射的菌懸液細胞數，細菌為106個/ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106～107個

/ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復活效應，所以照射時和照射后的處理應在紅燈下進行。

(二)操作步驟

1．將細菌培養液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。

2．將菌懸液放入一已滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內過濾，單細胞濾液裝入試管內，一般處于渾濁態的細胞液含細胞數可達108個／ml左右，作為待處理菌懸液。

3．取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養皿內，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應先開紫外線10min，讓紫外燈預熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。

4．取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml進行稀釋分離，計數活菌細胞數。

5．取照射菌液2ml于液體培養基中(300ml三角瓶內裝30ml培養液)，120r／min振蕩培養4～6h。

6．取中間培養液稀釋分離、培養。

7．挑取菌落進行篩選。亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內的DNA復制系統，從而誘發了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。

(二)操作步驟

1．單孢子懸液制備取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.o的磷酸緩沖液，用接種環刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個／ml，此為待處理孢子懸液。

2．MNNG溶液的制備用分析天平稱取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。3．誘變處理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養，30℃3天后計數。

4．死亡率計算將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離，30℃下培養3天。根據處理前后的活孢子數可計算出死亡率。

5．挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產量篩選．第五節營養缺陷型的選育營養缺陷型是指通過誘變而產生的缺乏合成某些營養物質如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養基中加入相應的營養成分才能正常生長的變異株。與營養缺陷型對應的是野生型。與篩選營養缺陷型有關的三類培養基

①基本培養基（M．M．，minimalmedium）——能滿足某一菌種的野生型或原養型菌株營養要求的最低成分的合成培養基。

②補充培養基（S．M．，

supplementalmedium）——在基本培養基中有針對性地補加某一種或幾種營養成分，以滿足相應的營養缺陷型菌株生長需要（其他營養缺陷型仍不能生長）的培養基。

③完全培養基（C．M．，

completemedium）——可滿足該菌各種營養缺陷型菌株營養需要的天然或半合成培養基。營養缺陷型的用途

營養缺陷型在生產上和科學研究上用途很大。目前生產氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術都必須有營養缺陷型的菌株為材料。篩選營養缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜一、誘變方法物理誘變化學誘變二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態。由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應加入一定量的抗生素，結果活化狀態的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發芽而不能濾過。

三、檢出缺陷型原理：在固體基本培養基和完全培養基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。具體方法：影印法、點種法、夾層法1．將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2．將完全培養基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標記方位。3．將基本培養基平皿和完全培養基平皿在標記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復印于上。

(一)影印法4．將CM和MM在恒溫箱中培養。5．二平皿相同方位進行比較，即可發現在MM平皿上長出的菌落少于GM平板上的。MM上未長而相應于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應有一定間隔。

(二)點種法也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應位置點種，然后一起培養，觀察其生長情況。此法結果明確，但工作量大。

(三)夾層法先在培養皿上倒一層基本瓊脂培養基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養基，培養24h，將出現的菌落標記，然后倒上一層CM瓊脂培養基，再培養。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點是，結果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。四、營養缺陷型生長譜的確定驗證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。生長譜測定的方法將缺陷型菌株培養后，收集菌體，制備成細胞懸液，與MM培養基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5～6個區間放上不同的營養組合的混合物或吸飽此組合營養物的濾紙圓片。培養后會在某組合區長出，就可測得所需營養。—個平皿測一個菌。以不同組合的營養混合物與融化涼至50℃的MM培養基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應位置，培養后根據在這些組合長出可推知其營養因子。在5～6個平皿上可測20株菌以上。第六節基因育種基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質粒或其他載體，將目的基因轉移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統內進行復制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優秀性狀經其間遺傳物質的交換而轉移給另—個細胞的方法。一個完整的基因克隆過程包括以下步驟１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導入宿主細胞；４、篩選、鑒定陽性重組子；５、重組子的擴增與／或表達。2.2基因重組一、質粒的特點1、質粒的存在并非微生物生命活動必需。2、每個細胞中存在的質粒數稱為該質粒的拷貝數。不同類型的質粒其拷貝數各異，同一質粒在不同條件下，拷貝數也可能差異很大，有嚴緊型和松弛型兩種。3、質粒DNA分子常呈現三種形態；常見的一種是共價、閉環狀DNA(CCCDNA)；其次是由于—條鏈有缺口而產生的開環DNA(ocDNA)；第三種是由雙環分子兩段均斷裂而產生的線性DNA。質粒載體二、各類質粒所賦予宿主細胞的不同表現型抗生素抗性：抗生素的產生；大腸桿菌素的產生；腸毒素的產生；復雜有機化合物的降解；限制性核酸內切酶和修飾酶的產生；殺傷性能。在自然條件下，許多質粒可經細菌接合或相似方式在宿主間相互轉移。在實驗室條件下，質粒也可經人工手段將其轉化入宿主細胞內。載體－宿主系統載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA；一般是通過改造質粒、噬菌體或病毒等構建的。載體應具備以下條件：１、能在適當的宿主細胞中復制；２、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源DNA插入；３、具有篩選標志以區別陽性與陰性重組分子；４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離；５、對于表達型載體還應具有與宿主細胞相適應的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。宿主細胞必須符合以下條件１、對載體的復制和擴增沒有嚴格的限制；２、不存在特異的內切酶體系降解外源DNA；３、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；４、重組缺陷型，不會產生體內重組；５、容易導入重組DNA分子；６、符合重組DNA操作的安全標準。目的基因的獲取一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內切酶。cDNA：用mRNA反轉錄成單鏈DNA，再經DNA聚合酶的作用產生雙鏈DNA。可去除真核生物基因中不表達的內含子。二、化學合成法制備DNA片段從蛋白質肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。三、聚合酶鏈反應法擴增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應（ＰＣＲ），以基因組DNA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。PCR技術根據需擴增片段的兩端設計引物。使DNA解鏈（高溫），引物結合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應。特點：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。DNA擴增PCR反應DNA片斷的克隆載體的條件：a復制起點b適宜的限制酶切點c選擇標記

DNA分子的體外連接

DNA片段的體外連接是重組DNA技術的關鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。一、DNA連接酶DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自Ｔ４噬菌體的DNA連接酶。T4DNA連接酶在分子克隆中主要用于：１、連接具有同源互補粘性末端的ＤＮＡ片段；２、連接雙鏈DNA分子間的平端；３、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。重組DNA導入宿主菌體外連接的重組DNA分子必須導入適當的受體細胞中才能大量的復制、增殖和表達。根據所采用的載體的性質，將重組DNA分子導入受體可有不同的方法。一、轉化指以細菌質粒為載體，將外源基因導入受體細胞的過程。轉化時，細菌必須經過適當的處理使之處于感受態－即容易接受外源DNA的狀態，然后利用短暫熱休克使DNA導入細菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉化細菌，它的優點是操作簡便、轉化效率高、適用于任何菌株。二、轉染和感染

利用噬菌體DNA作為載體時可經兩種方式導入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環化，再象重組質粒一樣地轉化進受體菌。但習慣上常把以噬菌體DNA為載體構建成的重組子導入細胞的過程統稱為轉染。重組克隆的篩選與鑒定

基因克隆的最后一步是從轉化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養以及重組子的擴增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結構、功能，或表達該基因的產物。一、抗藥性標志的篩選

如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如ampr或tetrr

，轉化后只有含這種抗藥基因的轉化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉化菌與非轉化菌區別開來。如果重組DNA時將外源基因插入標志基因內，該標志基因失活，通過有無抗菌素培養基對比培養，還可區分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉化菌落。二、β－半乳糖苷酶系統篩選

很多載體都攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼β－半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸，稱為α－肽，它表達β－半乳糖苷酶的C-端肽鏈。當載體與宿主細胞同時表達兩個片段時，宿主細胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal變為蘭色化合物，這就是所謂的α－互補。而重組子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互補，在含X-gal的平板上，含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。三、菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。四、內切酶圖譜鑒定經初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養后，再分離出重組質粒或重組噬菌體DNA，用相應的內切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內切酶消化鑒定插入的方向。重組DNA的鑒定遺傳學方法第七節原生質體育種

原生質體育種技術主要有原生質體融合、原生質體轉化技術，此外尚有原生質體誘變育種等。原生質休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業微生物遺傳學討論會上提出來的。

一、原生質體融合育種的特點(一)雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質體。(二)受接合型或致育型的限制較小：二親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。(三)遺傳物質傳遞更為完整：原生質體融合是二親株的細胞質和細胞核進行類似的合二為一的過程。

(四)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。（五有可能采用產量性狀較高的菌株作融合親株。

(六)提高菌株產量的潛力較大。

(七)有助于建立工業微生物轉化體系。二、原生質體融合育種步驟1．標記菌株的篩選和穩定性驗證。2．原生質體制備。3．等量原生質體加聚乙二醇促進融合。4．涂布于再生培養基，再生出菌落。5．選擇性培養基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。6．生產性能篩選。

三、原生質體融合育種的要點（一）標記菌種的選擇獲得標記菌種的方法是采用常規誘變育種，篩選出營養缺陷型或／和抗藥性菌株。這里最重要的是標記必須穩定。采用抗藥性菌株除可作標記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標記菌種。

(二)原生質體的制備原生質體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，結果剩下由原生質膜包住的類似球狀的細胞，它保持原細胞的一切活性。在放線菌和細菌中，制備原生質體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。

影響原生質體制備的因素1．菌體的前處理為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細菌加入亞抑制劑量的青霉素。2．菌體的培養時間為了使細胞易于原生質體化，一般選擇增殖期的菌體。3．酶濃度對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。4．酶處理溫度5．破壁時的pH值6．滲透壓穩定劑等滲透壓在原生質體制備中，不僅起到保護原生質體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結合，滲透壓穩定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物。第八節篩選新的代謝產物

一、開發新的代謝產物的途徑

(1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的檢閱方法篩選新的代謝產物。(2)對已知微生物的代謝產物進行化學修飾。(3)利用微生物轉化改造代謝產物的結構。(4)通過原生質體融合獲得新的代謝產物。(5)DNA重組技術。二、篩選微生物新的代謝產物

的程序

突變型菌株的篩選

一、產量性狀突變株的篩選

三、篩選微生物代謝產物的目標

篩選克服抗生素抗性菌株的活性物質；篩選抗腫瘤、抗病毒的活性物質；研究有藥理活性的酶抑制劑及免疫調節劑；尋找食品工業最好的酵母培養物；篩選降解有害物質的微生物以及治療上具有低毒、長效的化學藥物等。四、篩選微生物代謝產物的方法

(一)直接方法為了盡快確定微生物代謝產物的利用前途，在體外試驗測得活性后，可以將培養液的有效成分直接作用于機體，觀察被測樣品的療效。這種直接確定代謝產物用途的方法亦稱動物體內治療試驗。

(二)間接方法篩選醫用抗生素，可用細茵、真菌、病毒或腫瘤模型，尋找抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤抗生素、酶抑制劑、免疫制劑等有效物質。在預篩選時，多用瓊脂平扳擴散抑菌法。通過預篩選，直接測定最初分離物的生物活性，能加速篩選過程。

五、檢測系統

篩選過程的成功依賴于排除那些已知的或并非需要的代謝產物的檢驗方法，這樣才能識別出人們需要的化合物。性能簽別

性能鑒別是分離和篩選微生物代謝產物中最基礎的工作。鑒別可分為兩方面：一是對微生物方面進行形態、培養、