ICSFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加ICS號(hào)FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號(hào)FORMTEXT?????DBFORMTEXT??DBFORMTEXTXX/FORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????FORMTEXT新型鵝星狀病毒病診斷技術(shù)規(guī)程DiagnostictechniquesforNovelgooseastrovirusdiseaseFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)（送審討論稿）FORMTEXT2022.6.10FORMTEXT????-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施FORMTEXT????????發(fā)布DBXX/XXXXX—XXXX前??言本文件按照GB/T草。本文件由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件起草單位：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本文件主要起草人：李海琴、張帆帆、康昭風(fēng)、譚美芳、楊群、曾艷兵、韋啟鵬、黃江南、方紹培、譚佳、吳誠(chéng)誠(chéng)、季華員。新型鵝星狀病毒病診斷技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了新型鵝星狀病毒病的臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷和綜合判定技術(shù)要求。本文件適用于新型鵝星狀病毒病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件新型鵝星狀病毒Novelgooseastrovirus,NGoAstV新型鵝星狀病毒屬于星狀病毒科（Astroviridae）禽星狀病毒屬（Avastrovirus），星狀病毒（Astroviruses,AstV）是一種呈球形的RNA病毒，直徑為25~35nm，病毒表面無(wú)囊膜，有5~6個(gè)突起，用透射電子顯微鏡觀察呈五角星狀或六角星狀。新型鵝星狀病毒病Novelgooseastrovirusdisease,NGoAstVD新型鵝星狀病毒病是由新型鵝星狀病毒引起的多品種鵝關(guān)節(jié)痛風(fēng)和內(nèi)臟痛風(fēng)為主要特征的致死性傳染病。臨床診斷流行病學(xué)主要感染雛鵝。病鵝、隱性帶毒鵝、帶毒種蛋是主要傳染源，自然感染的潛伏期是3d，經(jīng)蛋感染的雛鵝最早可在3日齡發(fā)病，以5~20日齡最為常見(jiàn)，各品種的鵝均易感，死亡率30%~40%，最高可超過(guò)50%。臨床癥狀患鵝精神沉郁，食欲減退，飲水量增加，消瘦，四肢癱瘓，排白色稀便，隨后轉(zhuǎn)為黃綠色稀便，發(fā)病高峰期約在7~14日齡。病理變化剖檢病變剖檢病理變化主要表現(xiàn)為心臟、肝臟及肺臟表面有白色尿酸鹽沉積，腎臟呈花斑腎，輸尿管尿酸鹽沉積，關(guān)節(jié)腔尿酸鹽沉積嚴(yán)重，氣管也能見(jiàn)環(huán)狀白色尿酸鹽沉積，甚至腿肌出現(xiàn)大量尿酸鹽沉積。組織學(xué)病變患鵝腎小管上皮細(xì)胞脫落壞死，管腔內(nèi)充滿粉紅色的尿酸鹽沉積，腎間質(zhì)出血，腎小球腫脹；脾臟有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞空泡變性。臨床診斷結(jié)果判定符合4.1流行病學(xué)特征，病鵝出現(xiàn)4.2臨床癥狀和4.3病理變化，可判定為新型鵝星狀病毒病疑似病例，應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確診。實(shí)驗(yàn)室診斷實(shí)驗(yàn)室生物安全要求按照GB19489執(zhí)行。病毒分離細(xì)胞分離儀器和設(shè)備

生物安全柜、可調(diào)微量移液器（2-20μL、20-200μL、100-1000μL）、高壓蒸汽滅菌鍋、無(wú)菌離心管（1.5mL、15mL、50mL）、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、漩渦振蕩器、細(xì)胞培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板。試劑磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰酶、青霉素-鏈霉素溶液。分離病毒用細(xì)胞雞肝癌細(xì)胞系（LMH），LMH培養(yǎng)特性見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1]。細(xì)胞的準(zhǔn)備在37℃水浴中提前預(yù)熱消化液（0.25%胰酶）和DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液（見(jiàn)附錄A），將生長(zhǎng)良好的LMH細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗滌2次，棄去PBS，加入0.25%胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞，加入少量細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹散細(xì)胞，再加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散均勻后，按每孔1mL加入到細(xì)胞培養(yǎng)板；在37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36h，密度達(dá)到80%時(shí)用于細(xì)胞分離。病毒的分離培養(yǎng)將上述細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉，用無(wú)菌PBS洗滌3次后，將處理好的樣品接種到單層細(xì)胞上，每孔0.2～0.4mL。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱1h～2h，每隔15min輕輕搖動(dòng)一次，吸附后棄掉液體，用無(wú)菌PBS洗滌3次，加入細(xì)胞維持液（見(jiàn)附錄A），每孔1mL，于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5d，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)。待細(xì)胞液變黃，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶反復(fù)凍融3次，細(xì)胞液經(jīng)5000rpm離心10min后取上清用于檢測(cè)或置于-80℃保存。鵝胚分離儀器設(shè)備與耗材可調(diào)微量移液器（2-20μL、20-200μL、100-1000μL）、高壓蒸汽滅菌鍋、無(wú)菌注射器（1mL、5mL）、無(wú)菌剪刀、無(wú)菌鑷子、無(wú)菌離心管（1.5mL、15mL、50mL）、無(wú)RNA酶的帶濾芯槍頭、75%酒精、碘伏、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、孵化箱、種鵝蛋（新型鵝星狀病毒抗體陰性）。種蛋準(zhǔn)備將種鵝蛋置于孵化器中37℃下孵育10～11d，用于病毒分離。樣品準(zhǔn)備見(jiàn)附錄B。鵝胚接種將待檢樣品以0.2mL/胚的劑量經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10~11日齡鵝胚，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天照蛋2次，連續(xù)觀察6d，并記錄死胚情況。尿囊液收集棄掉接種后24h內(nèi)死亡的鵝胚，若接種2~6d內(nèi)鵝胚出現(xiàn)死亡，則收集死亡鵝胚的尿囊液；若接種6d內(nèi)鵝胚不出現(xiàn)死亡，則收集6d活胚的尿囊液。病毒的鑒定RT-PCR技術(shù)儀器設(shè)備與耗材PCR基因擴(kuò)增儀、核酸電泳儀、核酸電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、可調(diào)微量移液器（0.1-2.5μL、2-20μL、20-200μL、100-1000μL）、無(wú)RNA酶的1.5mL離心管、無(wú)RNA酶的PCR管、無(wú)RNA酶的帶濾芯槍頭。試劑商品化RNA提取試劑盒、無(wú)RNA酶去離子水、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（包括Buffer緩沖液、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑）、2×PCRMix、dNTPs(2.5nmol/Leach)、DNAMarker、電泳級(jí)瓊脂糖、Tis-乙酸電泳緩沖液TAE(50×TAE，1×TAE）、1%瓊脂糖、陽(yáng)性對(duì)照（新型鵝星狀病毒）、陰性對(duì)照（陰性尿囊液或正常細(xì)胞）。引物隨機(jī)反轉(zhuǎn)錄引物Random9反轉(zhuǎn)錄引物。RT-PCR引物針對(duì)鵝星狀病毒的RT-PCR檢測(cè)引物，參照附錄C。試驗(yàn)步驟病毒RNA的提取按照RNA提取試劑操作說(shuō)明書(shū)，提取待檢組織樣品總RNA。提取的RNA立即用于反轉(zhuǎn)錄，否則置于-80℃冰箱凍存。病毒cDNA的合成采用50μL體系，于無(wú)菌無(wú)酶EP管中依次加入RNA模板5μL、Buffer緩沖液10μL，隨機(jī)引物2μL、dNTPs(2.5mMeach)4μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)1μL，RNA酶抑制劑(40U/μL)2μL，補(bǔ)充無(wú)菌水至總體積共50μL，置于PCR儀中進(jìn)行cDNA合成，以25℃5min、50℃45min、85℃2min、4℃5min的程序進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，cDNA合成后進(jìn)行PCR擴(kuò)增或于-20℃保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件配置PCR反應(yīng)液，在樣品制備區(qū)加樣。采用25μL反應(yīng)體系，組成如下：2×PCRMix12.5μL上游引物（10μmol/L）1.0μL下游引物（10μmol/L）1.0μL模板cDNA2.0μL無(wú)RNA酶去離子水8.5μL總體積25.0μL瞬時(shí)離心，置PCR擴(kuò)增儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min；然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)：95℃30s，55℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min，4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物檢測(cè)將制備好的1.0%瓊脂糖凝膠放入電泳槽（帶加樣孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TAE）浸過(guò)膠面。DNAMarker、陰性對(duì)照產(chǎn)物、PCR產(chǎn)物和陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)物各取7μL加入膠孔內(nèi)，在110V電壓下電泳20～40min；在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察、拍照，并記錄結(jié)果。RT-PCR結(jié)果判定試驗(yàn)成立的條件陰性對(duì)照樣品無(wú)條帶，陽(yáng)性對(duì)照樣品出現(xiàn)489bp大小的條帶，試驗(yàn)條件成立。必要時(shí)，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果的判定在試驗(yàn)成立的前提下，待檢樣品出現(xiàn)489bp大小的條帶，判定待檢樣品為新型鵝星狀病毒PCR陽(yáng)性。否則為陰性，必要時(shí)，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測(cè)定。熒光RT-PCR技術(shù)儀器設(shè)備與耗材臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、渦旋振蕩器、可調(diào)微量移液器（0.1-2.5μL、2-20μL、20-200μL、100-1000μL）、無(wú)RNA酶的1.5mL離心管、無(wú)RNA酶的熒光定量PCR管、無(wú)RNA酶的帶濾芯槍頭。試劑商品化RNA提取試劑盒、無(wú)RNA酶去離子水、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（包括Buffer緩沖液、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、dNTPs(2.5nmol/Leach)、陽(yáng)性對(duì)照（新型鵝星狀病毒）、陰性對(duì)照（陰性尿囊液或正常細(xì)胞）。引物特異反轉(zhuǎn)錄引物Random9反轉(zhuǎn)錄引物。熒光定量RT-PCR引物和探針針對(duì)鵝星狀病毒的熒光PCR引物和探針，參照附錄C。試驗(yàn)步驟病毒RNA的提取同5.2.1.4.1。病毒cDNA的合成同5.2.1.4.2。熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件將試劑盒中預(yù)混液、引物和探針取出，置于冰上直至融化，將下列試劑依次加入到無(wú)RNA酶的熒光定量PCR管中。采用20μL反應(yīng)體系，組成如下：2×熒光定量PCR預(yù)混液10.0μL上游引物(10μmol/L)0.4μL下游引物(10μmol/L)0.4μL探針(10μmol/L)0.4μLcDNA1.0μL無(wú)RNA酶去離子水7.8μL總體積20.0μL將上述成分分別加入熒光定量PCR管中，輕輕混合均勻，瞬時(shí)離心，打開(kāi)熒光定量PCR儀和聯(lián)機(jī)計(jì)算機(jī)，將上述熒光定量PCR管置于熒光定量PCR儀內(nèi)，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?4℃30s，94℃5s，60℃30s，45個(gè)循環(huán)；4℃終止反應(yīng)。熒光定量PCR結(jié)果判定試驗(yàn)成立的條件閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)無(wú)特異性擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照Ct值應(yīng)＜28，則試驗(yàn)結(jié)果成立。試驗(yàn)結(jié)果的判定Ct值≤30，而且出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增線，表明樣品中存在新型鵝星狀病毒，判為陽(yáng)性。無(wú)Ct值，并且無(wú)擴(kuò)增曲線，或者Ct值＞35。表明樣品中無(wú)新型鵝星狀病毒，判為陰性。30＜Ct值＜35的樣品，判為可疑，必須重做。重做結(jié)果Ct值＜30者判為陽(yáng)性，否則判為陰性。RT-LAMP方法儀器設(shè)備與耗材高速冷凍離心機(jī)、水浴鍋、紫外分析儀、可調(diào)微量移液器（0.1-2.5μL、2-20μL、20-200μL、100-1000μL）、無(wú)RNA酶的1.5mL離心管、無(wú)RNA酶的PCR管、無(wú)RNA酶的帶濾芯槍頭。試劑商品化RNA提取試劑盒、無(wú)RNA酶去離子水、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（包括Buffer緩沖液、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑）、商品化LAMP擴(kuò)增試劑盒、TE可視染料、陽(yáng)性對(duì)照（新型鵝星狀病毒）、陰性對(duì)照（陰性尿囊液或正常細(xì)胞）。試驗(yàn)步驟病毒RNA的提取同5.2.1.4.1。病毒cDNA的合成同5.2.1.4.2。引物見(jiàn)附錄C。LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件2×buffer12.5μL酶混合物(EM)1.0μL內(nèi)引物-NGoAstV-FIP1.0μL內(nèi)引物-NGoAstV-BIP1.0μL外引物-NGoAstV-F30.5μL外引物-NGoAstV-B30.5μL環(huán)引物-NGoAstV-LB1.0μL環(huán)引物-NGoAstV-LF1.0μLcDNA2.0μL無(wú)RNA酶去離子水4.5μL總體積25.0μL將上述成分分別加入無(wú)菌的PCR管中，輕輕混合均勻、離心后置于PCR擴(kuò)增儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序64℃反應(yīng)60min，然后85℃反應(yīng)2min進(jìn)行酶滅活處理。LAMP結(jié)果判定試驗(yàn)成立條件反應(yīng)結(jié)束后，取TE染料加入產(chǎn)物中，混勻后在紫外線下觀察。在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)黃綠色熒光，同時(shí)陰性對(duì)照不出現(xiàn)黃綠色熒光的情況下，試驗(yàn)成立。結(jié)果判定在紫外線下被檢樣品出現(xiàn)黃綠色熒光，判為陽(yáng)性；在紫外線下被檢樣品未出現(xiàn)黃綠色熒光，判為陰性。綜合判定符合臨床診斷規(guī)定的疑似病例經(jīng)5.2.1、5.2.2、5.2.3中的任一方法檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性者，可判定為新型鵝星狀病毒病。_________________________________

（資料性附錄）

LMH細(xì)胞培養(yǎng)液配制細(xì)胞培養(yǎng)液在DMEM/F12培養(yǎng)液中加入10%FBS、1%青霉素-鏈霉素溶液（1萬(wàn)U/mL），用于LMH細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞維持液在DMEM/F12培養(yǎng)液中加入2%FBS、1%青霉素-鏈霉素溶液（1萬(wàn)U/mL），用于病毒感染后的LMH細(xì)胞維持。

（資料性附錄）

樣品的采集、處理、運(yùn)輸及保存儀器設(shè)備與耗材臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、高壓滅菌的剪刀、高壓滅菌的鑷子、旋渦振蕩器、可調(diào)微量移液器（2-20μL、20-200μL、100-1000μL）、無(wú)菌注射器（1mL、5mL）、無(wú)RNA酶的1.5mL離心管、無(wú)RNA酶的帶濾芯槍頭、0.22μm微孔濾器、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、一次性口罩、一次性手套和一次性帽子。樣品采集可采標(biāo)NY/T541。采集和樣品前處理過(guò)程中應(yīng)戴一次性手套、口罩、帽子，采集過(guò)程中樣品不得交叉污染。⑴組織樣品：采集死亡鵝或發(fā)病鵝的心、肝、肺、腎、脾等組織，采集病料時(shí)，用無(wú)菌的剪刀剪取組織樣品，將樣品裝入一次性無(wú)菌50mL離心管或一次性潔凈塑料自封袋，密封、編號(hào)，待檢。⑵細(xì)胞培養(yǎng)上清液：直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入到滅菌的1.5mL離心管中，加蓋、編號(hào)，待檢。⑶鵝胚尿囊液：直接將鵝胚尿囊液加入到滅菌的1.5mL離心管中，加蓋、編號(hào)，待檢。⑷肛拭子樣品：取泄殖腔棉拭子時(shí)，將棉拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)3圈并沾取少量糞便；將棉拭子頭一并放入盛有1mLPBS的無(wú)菌離心管中，蓋上管蓋并編號(hào)，10000rpm離心5min后取上清備用。樣品處理組織樣品在生物安全柜內(nèi)用滅菌剪刀剪碎后按照1:5加入無(wú)菌PBS（pH7.4、0.01

mol·L?1）進(jìn)行研磨，反復(fù)凍融3次后，在4℃下10000

rpm

離心15

min，上清液經(jīng)0.22

μm濾器過(guò)濾后-80

℃冰箱保存。細(xì)胞上清液和鵝胚尿囊液將細(xì)胞培養(yǎng)液和鵝胚尿囊液在4℃下10000

rpm

離心15

min，將上清液轉(zhuǎn)入滅菌的1.5mL離心管中，依據(jù)原樣品地編號(hào)。

（資料性附錄）

新型鵝星狀病毒RT-PCR引物、熒光RT-PCR的引物和探針、RT-LAMP引物新型鵝星狀病毒RT-PCR檢測(cè)引物見(jiàn)表E.1。表E.1鵝星狀病毒RT-PCR檢測(cè)用引物和探針引物名稱引物序列（5ˊ→3ˊ，上下兩行分別為上下游引物序列）產(chǎn)物大小，bp基因用途NGoAstV-FATTCTTGGCTCGGTTGTC