方法技術(shù)原理效果成本舉例化學(xué)法滲透沖擊滲透壓破壞細(xì)胞溫和便宜血紅細(xì)胞的破壞酶消化法細(xì)胞壁被消化，使細(xì)胞破碎溫和昂貴

增溶法表面活性劑溶解細(xì)胞壁溫和適中膽鹽作用于大腸桿菌脂溶法有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁并使之失穩(wěn)適中便宜甲苯破碎酵母細(xì)胞堿處理法堿的皂化作用使細(xì)胞壁融解劇烈便宜

方法技術(shù)原理效果成本舉例機(jī)械法勻漿法（片型）細(xì)胞被攪拌器劈碎適中適中動物組織及動物細(xì)胞研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎適中便宜

超聲波法用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理勻漿法（孔型）須使細(xì)胞通過的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎劇烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理詳細(xì)內(nèi)容：機(jī)械法

主要通過機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破碎的方法，常用的器械有組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽和研磨、壓榨器等。

1.

組織搗碎機(jī)

將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。一般用于動物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等，轉(zhuǎn)速可高達(dá)10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機(jī)械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。

2.

勻漿器

先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì)胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料，除玻璃外，還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼、人造熒光樹脂等。此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動物臟器組織。

存在的問題；較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細(xì)胞器，質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。

3.

研缽

多用于細(xì)菌或其他堅硬植物材料，研磨時常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。

4.

細(xì)菌磨

是一種改良了的研磨器，比研缽具有更大的研磨面積，而且低部有出口。操作時先把細(xì)菌和研磨粉調(diào)成糊狀，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可將細(xì)菌細(xì)胞完全磨碎。

物理法

主要通過各種物理因素使組織細(xì)胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有：

1.

反復(fù)凍溶法

原理：因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及

胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。

方法：將待破碎的細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。

特點：此法適用于組織細(xì)胞，多用于動物性材料，對微生物細(xì)胞作用較差。

2.

急熱驟冷法

將材料投入沸水中，維持85-90分鐘，至水浴中急速冷卻，此法可用于細(xì)菌及病毒材料。

3.

超聲波處理

用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，頻高于15～20KHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎。其破碎機(jī)理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時間、細(xì)胞濃度及首種類型等因素有關(guān)。

特點：操作簡單，重復(fù)性較好，節(jié)省時間；多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎。

存在問題：超聲波破碎在實驗室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時操作簡便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。空化作用是細(xì)胞破壞的直接原因，同時會產(chǎn)生活性氧，所以要加一些巰基保護(hù)劑。

化學(xué)及生物化學(xué)法

1.

自溶法

在一定PH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢媒M織細(xì)胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將細(xì)胞破碎的方法。此過程需較長時間，常用少量防腐劑如甲苯、氯仿等防止細(xì)胞的污染。

2.

酶溶法

利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細(xì)胞壁分解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。有些細(xì)菌對溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后，使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。

特點：

a)

此法適用多種微生物；

b)

具有作用條件溫和；

c)

內(nèi)含物成分不易受到破壞；

d)

細(xì)胞壁損壞的程度可以控制。

存在的問題：易造成產(chǎn)物抑制作用，這可能是導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個重要因素。而且溶酶價格高，限制了大規(guī)模利用。若回收溶酶，則又增加百分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶。有一定局限性，不適宜大量的蛋白質(zhì)提取，給進(jìn)一步純化帶來困難。

3.

化學(xué)滲透法

某些有機(jī)溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來。其作用機(jī)理；化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成。

特點：多用于破碎細(xì)菌，且作用比較溫和；提取核酸時，常用此法破碎細(xì)胞。

存在的問題：時間長，效率低；化學(xué)試劑毒性較強(qiáng)，同時對產(chǎn)物也有毒害作用，進(jìn)一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細(xì)胞。

小結(jié)

無論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。離心機(jī)的六大使用注意事項目前，實驗室常用的是電動離心機(jī)電動離心機(jī)轉(zhuǎn)動速度快，要注意安全，特別要防止在離心機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)期間，因不平衡或試管墊老化，而使離心機(jī)邊工作邊移動，一致從實驗臺上掉下來，或因蓋子未蓋，離心管因振動而破裂后，玻璃碎片旋轉(zhuǎn)飛出，造成事故。因此使用離心機(jī)時，必須注意以下操作。離心機(jī)套管底部要墊棉花或試管墊。電動離心機(jī)如有噪音或機(jī)身振動時，應(yīng)立即切斷電源，即時排除故障。離心機(jī)在預(yù)冷狀態(tài)時，離心機(jī)蓋必須關(guān)閉，離心結(jié)束后取出轉(zhuǎn)頭要倒置于實驗臺上，擦干腔內(nèi)余水，離心機(jī)蓋處于打開狀態(tài)。轉(zhuǎn)頭蓋在擰緊后一定要用手指觸摸轉(zhuǎn)頭與轉(zhuǎn)蓋之間有無縫隙，如有縫隙要擰開重新擰緊，直至確認(rèn)無縫隙方可啟動離心機(jī)。離心管必須對稱放入套管中，防止機(jī)身振動，若只有一支樣品管另外一支要用等質(zhì)量的水代替。分離結(jié)束后，先關(guān)閉離心機(jī)，在離心機(jī)停止轉(zhuǎn)動后，方可打開離心機(jī)蓋，取出樣品，不可用外力強(qiáng)制其停止運(yùn)動。離心期間，實驗者不得離開去做別的事。密度梯度離心的原理不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對細(xì)胞無毒。密度梯度離心機(jī)離心示例葉綠體的分離實驗原理將植物組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀、稠密度，也與離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。實驗步驟：1.選取新鮮的菠菜嫩葉，洗擦干后去除葉梗及粗脈，稱30g于0.35mol/L氯化鈉溶液150ml中置組織搗碎機(jī)或研缽中。2.利用組織搗碎機(jī)低速（5000r/min）勻漿，3~5min，或研磨成勻漿。3.用6層紗布過濾，濾液盛于燒杯中。4.取濾液4ml在1000r/min下離心2min，棄去沉淀。5.將上清液在3000r/min下離心5min，棄去上清液，沉淀即為葉綠體（混有部分細(xì)胞核）。6.沉淀用0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮。7.取葉綠體懸液1滴置于載玻片上，加蓋玻片后用普通光學(xué)顯微鏡觀察。

教學(xué)問題：高中生物必修1中研究細(xì)胞器的分離方法是差速離心法，必修2中研究DNA復(fù)制方式——半保留復(fù)制的方法是密度梯度離心法，兩者之間有什么區(qū)別？一、差速離心法差速離心法是交替使用低速和高速離心，用不同強(qiáng)度的離心力使具有不同質(zhì)量的物質(zhì)分級分離的方法。此法適用于混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大組分的分離。1．工作原理通常兩個組分的沉降系數(shù)差在10倍以上時可以用此法分離。例如某樣品中有大、中、小三個組分，用差速離心法分離時，把樣品放在離心管內(nèi)，先按大組分的沉降系數(shù)選擇離心轉(zhuǎn)速和離心時間，當(dāng)離心結(jié)束時正好使大組分全部沉降到離心管底部，這時中小組分中的一部分也會沉降到底部。若原始樣品液中三個組分的含量相等，則在原始樣品液中大組分占總組分量的三分之一。通過一次離心后分離出的大組分沉淀占總組分量約90%。如要進(jìn)一步提純可以把此沉淀物再溶解，再按大組分的沉降條件離心，得到大組分的第二次離心沉淀。通過多次對沉淀和上清液差速離心，可以把三個沉降系數(shù)有差別的組份分離提純，所以這個方法又稱為分步離心法。2．差速離心法的優(yōu)缺點差速離心法的優(yōu)點是樣品的處理量較大，可用于大量樣品的初分離。其缺點是分離復(fù)雜樣品和要求分離純度較高時，離心次數(shù)多，操作繁雜。由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中間損失，所以離心分辨力差。實際分離時由于離心時的對流、擴(kuò)散和收取沉淀時的污染，對于一些沉降系數(shù)相差不大的組分無法進(jìn)行完全的分離提純。產(chǎn)品的純度和回收率都達(dá)不到上述理論值。因此差速離心法主要用于大量樣品的初步分離提純。二、密度梯度離心法密度梯度離心法又稱為區(qū)帶離心法，可以同時使樣品中幾個或全部組分分離，具有良好的分辨率。離心時先將樣品溶液置于一個由梯度材料形成的密度梯度液體柱中，離心后被分離組分以區(qū)帶層分布于梯度柱中。1．工作原理不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。介質(zhì)梯度應(yīng)預(yù)先形成，介質(zhì)的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油。密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。

2．密度梯度離心法的優(yōu)缺點

密度梯度離心法的優(yōu)點是分離效果好，可一次性獲得較純凈顆