基因工程綜合性教學實驗

大腸桿菌堿性磷酸單酯酶基因

克隆表達純化

吳海珍王善利

趙健俞建瑛張惠展

華東理工大學

應用生物學系

二OO五年一月

第一部分

堿性磷酸單酯酶基因的

定位、克隆與表達

實驗流程圖

堿性磷酸單脂酶基因在染色體DNA上的雜交定位一一SouthernBlotting

堿性磷酸單脂酶基因的體外擴增一一PCR擴增

PCR體外擴增片段的克隆連接于T-載體一一連接

連接產物轉化大腸桿菌受體菌一一轉化

轉化子質粒DNA的抽提一一快速法制備質粒

轉化子的鑒定一一限制性內切酶酶切

目的轉化子DNA的大量制備一一堿法抽提質粒DNA

酶切回收克隆的目的基因片段一一回收目的基因

重組表達型質粒的構建一一連接、轉化、鑒定

重組大腸桿菌目的蛋白的表達一一蛋白電泳

實驗路線

E.co//ChromosomalDNA

E.co//ChromosomalDNA雜交定位

立PCR擴增

A'KF三4IAT-

1.5kbPMD18-T

■酶切鑒定

Hind\\\

Sph\

Pst\

Accl

EcoRISph\Sa/I

⑴0.4+3.7kb1.4+2.7kbphoA

1.2+2.9kb

⑵0.2+3.9kbXba\

BamHI

Kpn\

Sac\

EcoRI

目的蛋白

1DNA的酶切

摘要本單元要緊介紹限制性核酸內切酶的各類特性、酶的儲存方法與使用注意點，多種

酶聯合酶切的常用策略等。

1.1實驗原理

DNA重組技術中的第一步是從不一致來源的DNA（染色體DNA或者質粒DNA）上將

待克隆的DNA片段特異性切下，同時在載體DNA分子（通常為質粒DNA）上打開相對應

的缺口，然后將兩者連接成重組DNA分子。這一特異性的切割過程常由特定的限制性核酸

內切酶來完成。

限制性核酸內切酶幾乎存在于任何一種原核細菌中，它能在特定位置上催化雙鏈DNA

分子的斷裂，產生相應的限制性片段。早在20世紀50年代初微生物體內的限制核修飾作用

就已發現，10年后細菌的限制與修飾作用的分子機制被闡明。以大腸桿菌為例，在K株與

B株中都含有各自不一致的限制一一修飾系統，兩種不一致來源的一噬菌體SK與大B）長

期寄生于各自的宿主細胞中，宿主細胞內的甲基化酶已將其染色體DNA與噬菌體DNA特

異性的保護，封閉了自身所產生的限制性核酸內切酶的識別位點，故它們在感染相應的宿主

細胞（K株與B株）時DNA不被降解，因此感染頻率很高。當它們分別感染其他宿主細胞

時，由于沒有特異性的保護作用，入侵的DNA分子被宿主細胞的限制性內切酶切割降解，

從而感染頻率急劇下降，普遍能低一或者幾個數量極。這一現象普遍存在與原核細菌中。但

由于宿主細胞內的降解作用的不完全，入侵的DNA分子總有極少數能完整保留下來并得以

在細胞體內復制，而且在復制過程中被宿主細胞的甲基化酶所修飾。這修飾過的DNA分子

再重新制備后導入該宿主細胞時，感染頻率又能恢復到原先的高位，即限制一一修飾作用被

解除。

1.1.1限制性核酸內切酶的分類

目前在細菌中發現有600多種限制性核酸內切酶，根據其性質不一致可分為三大類（見

表1-1）。其中n類限制性核酸內切酶與其所對應的甲基化酶是分離的，不屬同一酶分子，

而且由于這類酶的識別切割位點比較專一，因此廣泛用于DNA的重組實驗。I類與III類酶

嚴格地說應該稱之限制一一修飾酶，由于它們的限制性核酸內切活性及甲基化活性都作為亞

基的功能單位，包含在同一酶分子中。

表1-1各類限制性內切酶的特性

I類酶II類酶HI類酶

酶分子三亞基雙功能酶內切酶與甲基化酶分開二亞基雙功能酶

4?6bp短序列，

識別位點二分非對稱序列5?7bp非對稱序列

大多數為回文結構

距離識別位點至少在識別位點中在識別位點下游24~26bp

切割位點

1OOObp,無特異性或者靠近識別位點處

限制性反應與甲基化反

互斥分開的反應同時競爭

應

ATP、Mg2+、ATP、Mg2+、S-腺音

限制作用所需的輔因子Mg2+

S-腺昔甲硫氨酸甲硫氨酸（非必需）

DNA重組中的用途無有無

1.1.2II類限制性核酸內切酶的基本特性

II類限制性核酸內切酶是Smith等人于1968年在流感嗜血桿菌d型菌株中發現的。該

類酶是一種分子量較小的單體蛋白，其雙DNA的識別與切割活性僅需要Mg2+,且識別與

切割位點的序列大都具有嚴格的特異性，因而在DNA重組實驗中廣泛使用。

目前已分離出400余種II類限制性核酸內切酶，鑒定識別及切割位點的有300多種，

商品化的酶NEB（NewEnglandBiolabs）公司品種最多，達220余種，其中在DNA重組實

驗中常用的有20多種。這些酶的統一命名由酶來源的生物體名稱縮寫構成（見圖1-1）

生物體屬名的第一個大寫字母

八生物體菌株株名或質粒名（非必需）

T

12345

、，生物體中發現限制性酶的次序

生物體種名的前兩個小寫字母

Sacl:Streptomycesachromogenes中發現的第一個限制性內切酶酶

Hindlll:Haemophiliasinfluenzaed中發現的第三個限制性內切酶酶

EcoRI:Escherichiacoli中發現的第一個限制性內切酶酶，編碼基因在抗藥性質粒口上

圖1-1限制性內切酶的命名原則與示例

1.1.2.1識別位點

n類限制性內切酶的識別位點具有180。旋轉對稱的回文結構，常用的識別序列往往為

6個堿基對，比如Hindlll的識別序列：

5'-A|AGCTT-3'

3'-TTCGA|A-5"

其中一部分的識別序列某一或者某兩位堿基并非嚴格專一,但都在兩種堿基中具有可替

代性，這種不專一性并不影響內切酶與甲基化酶的作用位點，只是增加了DNA分子上的酶

識別與作用頻率，比如Aval的識別序列就是典型的結構：

5'-CCCG^G-3'

3"-GGGCCC-5'

IAIT

有的酶識別位點為4或者5堿基對，如AluLHaelll與Sau3AI（見圖1-2）等，在DNA

上的出現頻率則較高，而象Sau3Al切割DNA后產生的是粘性末端，且與BamHI切割后的

粘性末端相同，為大規模克隆提供了可能。實際應用中利用Sau3AI高頻現象，結合DNA

的部分酶切策略進行研究也是常用的實驗手段。

5,-AGCT-3，5'-GGCC-3'5'-|GATC-3'

3）-TTCG-5'3'-CCGG-5*3,-CTAG|-5'

AlulHaelllSau3AI

圖1-2限制性內切酶的命名原則與示例

另外一些不常見的酶識別位點相對較長，在DNA鏈上出現頻率也相對較低，如Fsel

（5,-GGCCGGCC-3,）,出現頻率為1/48=l/65kb。實際上由于不一致生物體的DNA堿基含

量不一致，酶的識別位點的分布與頻率也不一致。大腸桿菌基因組中AT含量較豐富，因此

富含AT的識別序列（如Dral：5,-TTTAAA-3,；PshBI：5'-ATTATT-3'；SspI：5'-AATTAA-3'）

較為頻繁的出現，而鏈霉菌基因組因GC含量高，相應的富含GC堿基對的識別序列（Nael：

5,-GCCGGC-3,；Smal：5,-CCCGGG-3,；SacII：5,-CCGCGG-3,）較常見。

1.1.2.2粘性末端

限制性內切酶切割DNA產生的末端根據被切開的DNA末端性質的不一致(不考慮堿

基序列)可分兩大類：平端與粘端，而后者又可分為3，-OH突出或者5，-P突出兩種，分布

情況見圖1-3,故DNA分子的連接通常發生在同種限制性內切酶酶切后的DNA間。

(1)平頭末端EcoRV

5,——GATATC——3)5'-—GATATC——3

+

3'-CTATAG-5'3'——CTATAG——5

(2)5'粘性末端Hindlll

5'5—3,

5'--AAGCTT--3'

+

3,--TTCGAA-一5'3'——TTCGAxJG——5,

P5'3'QW

3'粘性末端PstI

/OH3：5'P\

5'——CTGCAG一—一3'5'——CTGCAZ、G——3,

+

3'——GACGTC——5'3'——Gx/ACGTC——5'

P5,3：0HZ

圖1-3DNA酶切產生的三種末端

實際上DNA重組應用中，由于不一致限內酶酶切能產生相同粘性末端，因此DNA分

子的連接可發生在不一致限內酶之間，常見的DNA分子連接情況見圖l-4o而在重組工作

中如沒有合適的酶切口產生相同的粘性末端，則可對酶切后的突出粘性末端進行補平，使用

平頭連接策略。

(1)同種酶產生的粘性末端

BamHI:5'-GGATCC-3'

5'—-G+GATCC-—3'5,--GjGATCC--3,

3'—-CCTAGG--5'3,一一CCTAGG——5,

(2)不同種酶產生的相同粘性末端

a：保留一種酶切位點

Sau3AI:5-GATC-3'和BamHI:5'-GGATCC-3'

5'-一+GATCC--3'5'—-IGATCC--3,

3,一CTAGG5，T3,一CTA*—5,

b：原酶切位點消失

Sall:5'-GTCGAC-3'和Xhol:5'-CTCGAG-3'

5'——G+TCGAG一一3'5'——GTCGAG一一3'

3'―CAGCTC—5'T3'—CAGCTC—5'

圖1-4DNA粘性末端的連接效果

1.1.2.3甲基化影響

大多數大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶與Dem甲基化酶,前者能夠在GATC序列中

腺喋吟N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一個胞喀咤C-5位置上引入甲基。部

分限制性內切酶對甲基化的DNA不能切害如Fbal與Mbol等，通常生物公司提供的內切

酶說明中均有說明。而要解除這種限制修飾作用通常有兩種方法：（1）選用上述酶的同功酶，

如Sau3ALDNA識別切割位點與Mbol相同；但不受甲基化影響；（2）利用甲基化酶缺失

的受體細胞進行DNA的制備，如E.coliJM110與鏈霉菌等，前者Dam與Dem甲基化酶已

敲出，而后者細胞內本就沒有甲基化酶，從這些細胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。

1.1.2.4近末端切割

基因工程的操作中經常要對DNA片段進行精細切割，在PCR產物中有些甚至只切割

一個堿基對。不一致的內切酶對裸露的酶切位點不能切斷，因此必需在酶切位點外側加上一

個或者幾個保護堿基，表1-2中列舉了常用的十五種內切酶在不一致保護堿基下的切割效

果，通常保護堿基大于三個堿基對時能完全切割。但是在有些PCR產物中即使保護堿基大

于五時也不一定能被有效切斷，這可能是PCR產物純化中殘留的雜質影響酶切或者是PCR

產物末端聚合不完整。

表1-2DNA末端酶切位點的切斷情況

末端堿基數

Enzyme

0123

BamHI-+++

Bglll--++

Clal-±++

EcoRI-±++

EcoRV-+++

Hindlll---+

Kpnl--++

Neol--++

PstI--±+

SacI-±++

Sall++++

Smal-+++

SphI--++

Xbal-±++

Xhol--±+

-：不能切斷；土不能完全切斷；+：完全切斷

1.1.3限制性核酸內切酶的使用

限制性核酸內切酶在基因工程屬常用工具酶，要緊用于基因物理圖譜的繪制、基因片段

的鑒定或者獲得、用于雜交的DNA探針的制備等，而酶切的條件操縱則是非常重要的。

1.1.3.1作用條件

在DNA的酶切反應中酶切條件是酶切成功的關鍵，要緊影響因素有：

（1）反應溫度常規酶切反應均在37℃進行，但有些酶的最佳反應溫度并不是此溫

度，如SmaL最適反應溫度為30℃,故最好根據所選用的酶確定反應溫度。當

使用聯合酶切進行實驗時特別要注意選擇的反應溫度是否都滿足兩者的要求，

假如有一個酶的最適溫度不符，建議分步酶切（見1.133）。

（2）緩沖體系廠商提供的限制性核酸內切酶有其相對應的緩沖液，通常的緩沖液

種類為4-10種左右，按鹽離子濃度可分為三大類：高鹽、中鹽與低鹽。緩沖液

配制為10X的母液，酶切時稀釋10倍。常規酶切中均選用最佳緩沖液進行酶切

反應，但聯合酶切時，根據廠商提供的聯合酶切的緩沖液選擇表（寶生物工程

公司）選擇緩沖液或者使用萬能緩沖液（Promega）o

（3）反應時間常規酶切反應時間為1.5小時，但可根據酶切對象與酶的用量將保溫

時間延長2?3小時，有的時候甚至能夠過夜。通常來說，在DNA量固定的前

提下，長時間酶切所需的酶量可適當減少，因此在大劑量酶切DNA時，能夠考

慮酶切過夜。另對特殊實驗，如對基因組DNA進行部分酶切，則在酶量投入一

定的前提下，減少反應時間降低對DNA切割的程度。

（4）加入酶量在底物（DNA）一定的條件下，酶量投入越多則酶切效果越好。但

實驗中常常出現酶量加入過多酶切效果反差的現象，這要緊是酶的儲存液中含

有50%的甘油，但酶量加入過多，超過酶反應體系的10%時，過多的甘油抑制

了限制性內切酶活性。因此，在酶切反應時，酶量的加入原則：不超過反應總

體積的10%,在能切開的條件下加入越少越好（可減少酶的Star活性）。

（5）DNA純度在滿足上述條件下影響酶切效果的要緊因素是DNA的純度，DNA

樣品中蛋白含量過高、有機溶劑（苯酚或者氯仿）的殘留、高濃度的RNA等。

另外DNA濃度過高也會導致酶切失敗，通常DNA的質量濃度在l|ig/|il體系中

能取得好的酶切效果。當發生不明原因的酶切失敗時，常用的解決方法是使用

稀釋酶切，馬上酶切體系放大（如從15）11->30日1）,將雜質相對濃度稀釋，這樣

不需多增加酶量就能取得較好的酶切效果

1.1.3.2酶切方式

酶切方式可分為部分酶切與完全酶切：

（1）部分酶切指的是同一DNA片段上的位點有些被切開而另一些未被切開，此法

要緊用于基因的克隆。在某些基因內部可能有此酶的切點，用完全酶切進行克

隆時難以得到完整基因。部分酶切實施方法：a）在不一致的時間從同一個酶反

應管中取樣終止反應，利用時間操縱酶切程度，該方法比較繁瑣，不易掌握得

恰到好處；b）固定酶切的反應溫度與反應時間，操縱酶的投入量，通常是在反

應管中加入不等量稀釋的酶，利用不一致酶濃度操縱酶切程度，該方法因易操

縱而被廣泛應用。

（2）完全酶切適用于除目的基因克隆以外的絕大多數DNA操作，比如載體的切

害U，酶切圖譜的制作，基因的鑒定與DNA片段的分離等。

L1.3.3雙酶切的解決方法

在DNA重組實驗中，經常會用雙酶切（甚至是3個酶切鑒定）鑒定重組子或者獲得不

一致粘性末端的DNA片段，而在廠商提供的聯合酶切緩沖液表中并不包含所有類型的酶，

即使提供了“萬能緩沖液”，有些酶的聯合酶切也不一定能取得比較好的效果，這里介紹兩

種通用的解決方法：

（1）分步酶切法對將進行的兩種酶的酶切使用分步的方法，即先選擇一個酶，使用

此酶的最佳反應條件進行酶切，酶切完全的DNA進行沉淀后再溶解，然后選用

第二個酶進行最佳反應。在酶切時，通常選擇便宜的酶進行酶切沉淀，而后在進

行第二個酶的酶切反應。此方法通用性較強，聯合酶切也比較完全，但較耗時，

而且DNA在沉淀時后有部分缺失，要求開始時DNA的投入量要比較高。

（2）同步酶切法取兩種酶的最佳緩沖液各50%加入到酶切反應體系中，并同時加

入兩種酶進行反應。特別是對不一致廠商提供的酶進行聯合酶切時，即可節約時

間也可取得比較好的酶切效果。

1.1.3.4酶切反應設計

在進行酶切反應時，首先要確定需切割的DNA量，根據DNA的量確定總反應體系與

酶量(最多占1/10),通常體系如下：

total(jil)ddH2O(|il)10XBuffer(⑼Enzyme(jil)DNA(50ng/|il)

2014.520.53

通常較好的酶切體系DNA的投入量不高于L5Ng/50)il,當DNA的投入量為l.Sfig/ZOjil

時酶切將發生困難。加樣順序：水-＞緩沖液-＞DNA--＞酶。各組分加完后要混合均勻，并用

離心機低轉速將溶液離心至管底。

1.1.3.4酶切失敗的原因及處理辦法

酶切失敗要緊表現為兩方面：

(1)不完全酶切甚至是DNA基本未發生酶切；要緊原因有：a)緩沖體系不合適，

可進行重新酶切；b)酶量加入過多而導致甘油抑制酶活，可將反應體系適當稀

釋；c)DNA樣品雜質含量高，可使用稀釋酶切或者將DNA樣品重新抽提后酶

切

(2)DNA被降解(不成帶狀)；要緊原因是DNA樣品中含有痕量的DNA酶，建議

重新抽提除去DNA酶。

L2試劑與器材

1.試劑(1)常用的限制性內切酶

(2)酶切緩沖液，購酶時附

(3)無菌雙蒸水

(4)DNA樣品

2.器材(1)eppendorf管

(2)槍頭

(3)恒溫水浴

(4)移液器

1.3實驗步驟

設計酶切方案

□

分別加無菌雙蒸水于eppendorf管中(管上要編號)

口

加入10X的緩沖液

口

加入DNA樣品

口

對應加入限制性內切酶

口

混合，低轉速離心5秒

口

37℃,保溫1.5小時

口

取出電泳分析或待用

2DNA的凝膠電泳

摘要本單元要緊介紹DNA電泳的基本原理及各類影響因素，學習制膠，電泳等基本分析

技術。

2.1實驗原理

DNA電泳是基因工程中最基本的技術，DNA制備及濃度測定、目的DNA片段的分離，

重組子的酶切鑒定等均需要電泳完成。根據分離的DNA大小及類型的不一致，DNA電泳

要緊分兩類：

(1)聚丙烯酰胺凝膠電泳適合分離Ikb下列的片段，最高分辨率可達Ibp,也用于分離

寡核甘酸，在引物的純化中也常用此中凝膠進行純化，也稱PAGE純化。

(2)瓊脂糖凝膠電泳可分離的DNA片段大小因膠濃度的不一致而異,膠濃度為0.5?0.6%

的凝膠能夠分離的DNA片段范圍為20bp-50kbo電泳結果用澳化乙錠(EB)染色后可直

接在紫外下觀察，同時可觀察的DNA條帶濃度為納克級，而且整個過程通常1小時即可完

成。由于該方法操作的簡便與快速，在基因工程中較常用。

2.1.1瓊脂糖凝膠

瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1,3連接的口比喃型B-D-半乳糖與1,4連接的3,6脫

水毗喃型阿a-L-半乳糖構成，形成相對分子量為1。4?105的長鏈。瓊脂糖加熱溶解后分子呈

隨機線團狀分布，當溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結構，

而隨著瓊脂糖濃度不一致形成不一致大小的孔徑。表2-1給出了不一致濃度凝膠對DNA片

段的線性分離范圍。

表21不―致類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍

瓊脂糖/%標準高強度低熔點低粘度低熔點

0.3

0.5700bp?25kb

0.8500bp?15kb800bp?lOkb800bp?lOkb

1.0250bp?12kb400bp~8kb400bp?8kb

1.2150bp?6kb300bp?7kb300bp~7kb

1.580bp-4kb200bp~4kb200bp~4kb

2.0100bp~3kblOObp?3kb

3.0500bp~lkb500bp~Ikb

4.0100bp~500bp

6.010bp~lOObp

由于瓊脂糖凝膠是通過氫鍵的作用，因此過酸或者過堿等破壞氫鍵形成的方法常用于凝

膠的再溶化，象NaCICU能用于凝膠的裂解，通常的凝膠回收試劑盒利用的也是這一原理。

隨著實驗技術的進展，也針對不一致用途開發了各類類型的瓊脂糖凝膠：（1）低熔點瓊

脂糖凝膠，用于DNA片段的回收，且由于該種凝膠中無抑制酶，可在膠中進行酶切、連接

等；（2）高熔點凝膠，可分離小于Ikb的DNA片段，專用于PCR產物的分析；（3）快速

凝膠，電泳速度比普通凝膠中快一倍，可節約實驗時間；（4）???,適用于DNA大片段

的分離。（5）其它類型。各生產商還開發很多類型的凝膠，可根據實驗要求選擇不一致類型

的，選擇原則是考慮合適的機械強度與熔點。

2.1.2DNA電泳影響因素

DNA為堿性物質，在電泳（緩沖液pH=8）時帶負電荷，在一定的電場力作用下向正極

泳動。而DNA鏈上的負電荷伴隨著DNA分子量的增加而增加，荷質比是一常數，故電泳

中DNA的分離類似分子篩效應。電泳中影響DNA分子泳動的因素很多，要緊分兩方面：

DNA分子特性與電泳條件。

（1）DNA分子大小DNA分子越大在膠中的摩擦阻力就越大，泳動也越慢，遷移速

率與線狀DNA分子質量的對數值成反比。

（2）DNA分子構型關于質粒DNA分子即使具有相同分子質量，因構型不一致也

會造成電泳時受到的阻力不一致，最終造成泳動速率的不一致。常規電泳中質

粒DNA分子的3種構型泳動速率：超螺旋最快、線狀分子次之，開環分子最慢。

（3）不一致的膠濃度關于同種DNA分子膠濃度越高，電泳速率越慢。不一致膠濃

度關于DNA片段呈線性關系有所區別，濃度較稀的膠線性范圍較寬，而濃的膠

對小分子DNA片段呈現較好的線性關系。因此常規實驗中關于小片段DNA分

子的分離使用高濃度的膠分離（有的時候甚至用2%的凝膠），而關于分離大片

段則用低濃度的凝膠。

（4）電場強度電泳時為了盡快得到實驗結果，所用的電場強度約為5V/cm,這樣

的場強下雖能得到結果，但分辨率不高。在精確測定DNA分子大小時，應降低

電壓至IV/cm。電場強度偏高時電泳分離的線性范圍會變窄，電壓過高時也會

由于電泳中產生的大量熱量導致DNA片段的降解。實驗中要根據需要選擇合適

電壓，如關于DNA大片段的分離可適當選擇較低電壓進行（在Southern雜交中

的DNA電泳），避免托尾現象的產生；而關于小分子DNA,由于其在凝膠中的

快速擴散會導致條帶模糊，可選用相對較高的電泳以縮短電泳時間。

（5）澳化乙錠簡稱EB,電泳中的染色劑，具有扁平結構，能嵌入到DNA堿基對

間，對線狀分子與開環分子影響較小而對超螺旋態的分子影響較大。當DNA分

子中嵌入的EB分子逐步增多時，原先為負超螺旋狀態的分子開始向共價閉合環

狀轉變，電泳遷移速度由快變慢；當嵌入的EB分子進一步增加時，DNA分子

由共價閉合環狀向正超螺旋狀態轉變，這時電泳遷移速率又由慢變快。這個臨

界點的游離EB質量濃度為0.1g/ml~0.5g/mL即電泳時所加的濃度。因此通

常電泳能夠忽略此因素，而關于特殊電泳，消除此因素影響可使用電泳后染色。

(6)電泳緩沖液目前有3種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳：TAE、TBE與

TPE,其構成及特點見表2.2。通常常用的DNA電泳選用TAE較多，其電泳時

間較快，而且成本比較低，但是其緩沖容量較低，需經常更換電泳液。

表2.2常用DNA電泳緩沖液

緩沖液存儲液構成成份/L特點及用途

TAE50X雙鏈DNA分子的泳動速率比另兩者快10%

242gTris超螺旋在其中電泳時更符合實際分子質量

57.1ml冰乙酸回收DNA片段時首選，大片段分離效果好

100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)緩沖容量小，過夜電泳不可選用

TBE5X小片段(<lkb)分離效果好

54gTris回收效率差而不宜用于回收電泳

27.5硼酸緩沖容量大，過夜電泳適合

20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)

TPE10X磷酸鹽在乙醇作用下析出，也不適合回收電泳

108gTris緩沖容量大，過夜電泳適合

15.5ml磷酸(85%,1.679g/ml)

40ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)

2.1.3DNA電泳上樣緩沖液

電泳中DNA點樣前務必加入一定量的上樣緩沖液，要緊作用如下：

(1)螯合Mg2+,防止電泳過程中DNA被降解，通常上樣緩沖液中含lOmmol/1的

EDTA?

(2)增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內，通常上樣緩沖液中加入一定濃度的

甘油或者蔗糖，這樣能夠增加樣品的比重。而在大片段電泳中使用Ficoll(聚蔗

糖)，可減少DNA條帶的彎曲與托尾現象。

(3)指示劑監測電泳的行進過程，通常加入泳動速率較快的澳酚藍指示電泳的前沿,

它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。

目前廠商提供的限制性內切酶中都有贈送的上樣緩沖液，通常為10X上樣緩沖液,DNA

樣品中僅需加入1/10的量即可，加入過多的上樣緩沖液會造成電泳輕微的托尾現象。

2.1.4DNA電泳上樣量的操縱

在分析性電泳中，通常樣品投入量達50?100ng/帶即可觀察到清晰結果，而關于珍貴

DNA樣品則上樣量達電泳的最低分辨率5?10ng/帶也可。而關于一定量的DNA,當電泳時

使用較薄的梳子制膠，則電泳時DNA條帶相對較窄，觀察較清晰；而隨著電泳時間的延長,

由于DNA分子本身有一定的擴散，電泳條帶也會變淺。關于染色體DNA的酶切片段包含

各類大小的條帶，上樣量即使超過1011g條帶也不可能托尾，而單一條帶(>10kb)當上樣

量超過200ng就有可能產生托尾現象。

2.1.5DNA電泳的標準分子量

目前各廠商開發了各類類型的標準分子量，有廣泛用于PCR產物鑒定的小分子Marker,

也有常規用的大分子Marker,圖2-1為TAKARA公司提供的DNA標準分子量電泳(示意)

圖。

100bpDNALadderMarkerDNAMarkerDL2.000WideRangeDNALadderMarker

圖2-1常用的DNA標準分子量電泳圖

2.2試劑與器材

1.試劑(1)50XTAE電泳緩沖液

242.0gTris堿

100ml0.5mol/EDTA(pH=8.0)

57.1ml冰醋酸

(2)EB母液(Img/ml)

稱取一定量的EB溶于無菌水中，室溫避光儲存

凝膠中濃度為0.5)ig/ml

EB為強誘變劑，實驗中要防止污染

(3)DNA標準分子量(自制)

片段大小依次為：0.5,1.1,1.6,2.7,3.1,4.1,5.4,9.4與

17

單次電泳電樣量3?4m即可，回收電泳加倍

(4)10XLoadingbuffer(pH7.0)

EDTA50mM

甘油60%

XyleneCyanolFF(W/V)0.25%

BromophenolBlue(W/V)0.25%

(5)無菌雙蒸水

(6)瓊脂糖

2.器材(1)eppendorf管

(2)槍頭

(3)移液器

(4)電泳槽

(5)電泳儀

(6)微波爐

(7)電泳板與梳子

(8)紫外投射分析儀

(9)數碼相機(帶紫外濾色鏡與近射鏡)

2.3實驗步驟

(1)用IXTAE-Buffer按照被分離DNA分子的大小配制一定濃度(0.7%)的瓊脂糖凝膠50ml,

在微波爐中加熱至瓊脂糖溶解。

(2)待溶液冷卻至50℃左右,加入漠化乙錠(貯存液：用水配制為lmg/ml)至終濃為0.5座/向

充分混勻。

(3)用透明膠封固玻璃板兩頭，在距底板0.5~l.0mm的位置上放置梳子，將溫熱的瓊脂糖凝

膠倒入膠模中，凝膠厚度在3~5mm之間。

(4)在凝膠完全凝固后，撕去透明膠，小心地將玻璃板移至裝有IXTAE緩沖液的電泳槽中，

輕輕地拔去梳子，且使緩沖液沒過膠面約1mm。

(5)DNA樣品與lOXLoading-buffer(含有澳酚藍與甘油等物質)混合后，用微量取樣器慢慢將

混合物加至樣品槽中。

(6)蓋上電泳槽并通電，使DNA向陽極(紅線)移動，使用電壓為80?100V。

(7)澳酚藍在凝膠中移出適當距離后切斷電流，取出玻璃板，在紫外燈下觀查凝膠。

(注：關于DNA片段回收的電泳通常建議使用0.6%低濃度的凝膠，而且使用的電泳液需第

一次使用，電泳槽要洗凈)

3DNA的制備

摘要本單元要緊介紹質粒DNA與細菌染色體DNA的常規制備方法，要求學會根據不一

致實驗需求選擇不一致實驗方法。

3.1實驗原理

3.1.1質粒DNA的基本特性

質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩固遺傳因子，大小從l-200kb不等，為雙鏈、閉

環的DNA分子，并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。質粒要緊發現于細菌、放線菌與真菌

細胞中，具有自主復制與轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數，并表達所攜帶的遺

傳信息。質粒的復制與轉錄要依靠于宿主細胞編碼的某些酶與蛋白質，如離開宿主細胞則不

能存活，而宿主即使沒有它們也能夠正常存活。質粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如

對抗生素的抗性等。F質粒(又稱F因子或者性質粒)、R質粒(抗藥性因子)與Col質粒(產

大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質粒。

質粒在細胞內的復制通常有兩種類型：緊密操縱型(Stringentcontrol)與松馳操縱型

(Relaxedcontrol)o前者只在細胞周期的一定階段進行復制，當染色體不復制時，它也不能復

制，通常每個細胞內只含有1個或者幾個質粒分子，如F因子。后者的質粒在整個細胞周

期中隨時能夠復制，在每個細胞中有許多拷貝，通常在20個以上，如ColEl質粒。在使用

蛋白質合成抑制劑-氯霉素時，細胞內蛋白質合成、染色體DNA復制與細胞分裂均受到抑制，

緊密型質粒復制停止，而松馳型質粒繼續復制，質粒拷貝數可由原先20多個擴增至

1000-3000個，如今質粒DNA占總DNA的含量可由原先的2%增加至40-50%。

利用同一復制系統的不一致質粒不能在同一宿主細胞中共同存在，當兩種質粒同時導入

同一細胞時，它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭，在一些細胞中，一種質粒

占優勢，而在另一些細胞中另一種質粒卻占上風。當細胞生長幾代后，占少數的質粒將會丟

失,因而在細胞后代中只有兩種質粒的一種，這種現象稱質粒的不相容性（Incompatibility）。

但利用不一致復制系統的質粒則能夠穩固地共存于同一宿主細胞中。

質粒通常含有編碼某些酶的基因，其表型包含對抗生素的抗性，產生某些抗生素，降解

復雜有機物，產生大腸桿菌素與腸毒素及某些限制性內切酶與修飾酶等。

質粒載體是在天然質粒的基礎上為習慣實驗室操作而進行人工構建的。與天然質粒相

比，質粒載體通常帶有一個或者一個以上的選擇性標記基因（如抗生素抗性基因）與一個人

工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，

使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這

些用途包含通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、產生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉

錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個理想的克隆載體大

致應有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳操縱型；（2）具有多種常用的限制性內

切酶的單切點；（3）能插入較大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的

質粒載體大小通常在Ikb至10kb之間，如pBR322、pUC系列、pGEM系列與pBluescript

（簡稱pBS）等。表3-1列舉了不一致復制子類型的質粒。

表3-1常見質粒特性及復制子類型

質粒復制子類型拷貝數用途

pBR322pMBl15?20早期克隆載體

pUC系列pMBl（改良）500—700常規克隆載體

pET系列pMBl15?20常規表達載體（T7）

pGEM系列pMBl（改良）300?700克隆與表達載體（T7）

pSP系列pMBl（改良）300—700克隆與表達載體（T7）

3.1.2質粒DNA抽提的基本原理

在細菌細胞內，共價閉環質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA

外，還會產生其它形式的質粒DNA。假如質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發生一處或者多處

斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的張力，形成松馳型的環狀分子，稱開環DNA（Opencircular

DNA,簡稱ocDNA）；假如質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA（LinearDNA）。

當提取的質粒DNA電泳時，同一質粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環與線狀分子

的泳動速度快。

3.1.2.1堿裂解法質粒DNA的抽提

要緊包含3個基本步驟：裂解細胞、分離與純化質粒DNA。

（1）裂解細胞

基本上先加入溶菌酶作用一段時間，破壁后再加入非離子型去污劑或者直接加入堿性

SDS等與作煮沸處理，以便破壁與膜，處理的同時也能去除細胞碎片、染色體DNA等雜質。

非離子去污劑法較溫與，適用于抽提10kb左右的