養牛與牛病防控技術1.肉牛雜交改良技術任務目標知識目標：能夠準確識別肉牛品種；掌握常見肉牛品種的經濟類型、外貌特征、生產性能。能力目標：能夠結合生產情況選擇適宜的肉牛品種；評價品種適應性。素質目標：認識中國肉牛品種與中國自主知識產權的重要性，品種是核心競爭力。小結目前全世界有60多個專門化的肉牛品種，按體型大小和產肉性能，大致可分為下列三大類中、小型早熟品種大型歐洲品種含瘤牛血液的品種任務目標知識目標：記住肉牛雜交改良主要方式。能力目標：能夠開展肉牛雜交改良課程思政目標：知道育種工作的艱辛，樹立職業自信，增強自我價值認同感，積極投身于畜牧業發展中，并將自我發展與畜牧業和地方經濟緊密結合，激發內在學習動力。肉牛雜交改良技術一、肉牛雜交生產中母系和父系的基本要求母系必須有終身穩定的高受孕力以每頭母牛計算的低飼養成本和低土地占用成本，一般要求體型較小的個體性成熟早而不易難產良好的泌乳性能適應粗放和不良的條件體質結實，長壽高飼料報酬鮮嫩的肉質較好的屠宰性狀等父系必須具有快速的生長能力改進眼肌面積的高強度優勢高屠宰率和高瘦肉率碩大的體型體早熟等二、肉牛雜交體系建設的原則在引入品種改良本地黃牛的基礎上繼續組織雜交優勢用對配套系母系的要求選擇具備有理想母性的母牛，用對配套系父系的要求選擇具有理想長勢和胴體特征的公牛，利用其互輔性，保持雜交優勢的持續利用組裝或結合兩個或兩個以上品種的優勢開展肉牛配套系生產，在可能的情況下形成新的地方類群雜種母牛本身具有雜種優勢，應當很好的利用，雜種公牛中也往往有很好的優秀個體，可走北美的雜種公牛作種用之路，逐漸形成綜合雜交或合成系的做法三、雜交改良方式（一）經濟雜交使用不同品種（系）進行雜交，利用雜種優勢，提高經濟性能的雜交繁育方法。雜交后代生活力強，生長速度快，降低了生產成本。進行經濟雜交時應注意配合力測定，因為并不是所有品種間交配都產生雜種優勢；用于雜交的父本應生長速度快，胴體品質好；母本則要母性能力強。以生產性能較低的母牛與引入品種的公牛進行雜交，其后代不作種用，全部作商品牛出售。其目的是為了利用雜交一代的雜種優勢。如夏洛來牛、利木贊牛、西門塔爾牛等與本地牛雜交后代的肥育。三、雜交改良方式1.單雜交：采用兩個品種雜交，雜交一代不論公母全部作經濟利用。三、雜交改良方式2.輪回雜交：兩個或更多個品種間輪回雜交，雜種母牛繼續繁殖，雜種公牛全部作肥育用。三、雜交改良方式3.“終端”公牛雜交體系：就是用B品種公牛與A品種母牛交配，雜交1代母牛再與第三個品種C的公牛交配，雜交2代中無論公母全部作經濟用，最終停止在C品種公牛的雜交稱“終端”公牛雜交體系。三、雜交改良方式4.種間雜交：種間雜交屬遠緣雜交，養牛業中屬于遠緣雜交的有普通牛與瘤牛、普通牛與牦牛的雜交。牦牛與普通牛可進行種間雜交，雜種稱為犏牛。普通公牛與母牦牛雜交，雜一代（F1）稱“真犏牛”，雜二代（F2）稱“阿果牛”或“尕利巴”，雜三代（F3）稱“假黃牛”或“撒尾黃”。公耗牛與母黃牛雜交，雜一代（F1）稱“假犏牛”，雜二代（F2）稱“牦渣”，雜三代（F3）稱“假牦牛”。牦牛與普通牛之間的雜交，雜種后代的生產性能、體重、體格和生長發育比牦牛有較大提高。雜種后代中1～3代的雄性均不育，第4代雜種公牛有正常生育力。在牦牛改良利用中除用黃牛雜交外，還采用荷斯坦牛、西門塔爾牛等品種與牦牛雜交。（二）導入雜交當一個品種已具有多方面的優良性狀，其性能已基本符合育種要求，只是在某一方面還存在個別缺點，并且用本品種選育的方法又不能使缺點得以糾正時，就可利用具有這些方面優點的另一品種公牛與之交配，以糾正其缺點，使品種特性更加完善，這種方法稱作導入雜交。雜交一次，雜交后代公母畜分別與本地品種母、公畜進行回交。（三）級進雜交吸收雜交或改造雜交。引入品種為主、原有品種為輔的一種改良性雜交。雜種后代公畜不參加育種，母畜反復與引入品種雜交。這種方式雜交一代可得到最大的改良。隨著級進代數的增加，雜種優勢逐代減弱并趨于回歸。因此，級進雜交并非代數越高越好。實踐證明，級進至3～4代較好。級進三代并加以固定可育成品種。級進雜交在我國很早就用來改良黃牛，不少地區的奶牛就是利用荷斯坦牛對本地區黃牛實行級進雜交發展起來的。中國荷斯坦牛就是在級進雜交高代牛群的基礎上繁衍而來的。在肉用性能方面，用西門塔爾牛、短角牛、利木贊牛、夏洛來牛等公牛與本地牛級進雜交，逐代改進本地牛的產肉性能。（四）三品種雜交兩個品種進行雜交，所生雜一代母牛與第三個品種公牛進行第二次雜交，所生三元雜種全部肥育出售。這種雜交體系能使各品種的優點相互補充而獲得較高的生產性能。（五）育成雜交就是應用2個或2個以上品種雜交培育新品種（系）的方法。兩品種雜交簡稱簡單育成雜交；兩個以上品種雜交稱復雜育成雜交。育成雜交包括雜交創新、橫交固定和擴群提高3個階段。我國第一個乳肉兼用品種三河牛，是由分布于呼倫貝爾草原的蒙古牛和許多外來品種經過半個多世紀的雜交選育而成。中國草原紅牛和新疆褐牛也是采用育成雜交的方法，分別引用乳肉兼用型的短角牛和瑞士褐牛及含有瑞士褐牛基因的阿拉托烏牛對本地黃牛進行長期改良，級進至3或3代以上橫交固定，經長期選育而成的。2.牛的妊娠診斷技術任務目標知識目標：能夠準確識別肉牛品種；掌握常見肉牛品種的經濟類型、外貌特征、生產性能。能力目標：能夠結合生產情況選擇適宜的肉牛品種；評價品種適應性。素質目標：認識中國肉牛品種與中國自主知識產權的重要性，品種是核心競爭力。小結目前全世界有60多個專門化的肉牛品種，按體型大小和產肉性能，大致可分為下列三大類中、小型早熟品種大型歐洲品種含瘤牛血液的品種任務目標知識目標：能對配種后母牛及早地作出診斷，掌握母牛妊娠、分娩征兆，熟悉牛妊娠檢查及接產方法。能力目標：能正確進行牛妊娠診斷，做好母牛接產和產后護理工作。課程思政目標：新生命的誕生來自母親的艱辛孕育，感恩母親。中國文化的特點之一是以母親為核心，以女性為紐帶的文化現象。例如地球母親，黃河母親和中國母親等，隨中國文化發展一直傳承至今。母親的言傳身教能讓子女受用一生，更多了一份對國家和人民的責任與擔當。養牛技術養牛技術牛的妊娠診斷技術養牛技術主講人：姜明明前言

妊娠診斷是確定母牛配種后是否已經妊娠的一項技術。搞好妊娠診斷，可以防止母牛空懷，提高繁殖率，尤其是早期妊娠診斷更為重要。經妊娠診斷，如果已經妊娠的母牛，應加強飼養管理，保證胎兒的發育，維持母牛的健康；對未妊娠的母牛，及時檢查，找出未孕原因，采取相應的技術措施。牛的妊娠診斷技術（一）外部觀察法牛妊娠后，發情周期停止，食欲增強，營養狀況改善，毛色光亮，性情變得較為溫順，在妊娠后5個月左右，牛腹圍增大，乳房增大，這種方法雖然簡單，容易掌握，但不易早期確切診斷，還應結合其他方法來確定。用開膣器進行妊娠診斷向陰道內插入開膣器時感到有阻力；打開開膣器后，可看到粘膜蒼白、干燥，宮頸口關閉，向一側傾斜。（二）陰道檢查法妊娠達1.5～5個月時，子宮塞的顏色變黃、稠濃；6個月后，粘液變得稀薄、透明，有些排出體外在陰門下方結成痂塊。子宮頸位置前移，陰道變得深長。（二）陰道檢查法配種后19～22d母牛配種后19～22d子宮變化不明顯，如果卵巢上有發育良好的黃體，可懷疑已受孕。（三）直腸檢查法（三）直腸檢查法妊娠30d后兩側子宮大小開始不一，孕角略為變粗質地松軟，有波動感，孕角的子宮壁變薄；空角較堅實，有彈性。用手握住孕角，輕輕滑動時可感到有胎囊，用拇指與食指捏起子宮角，然后放松，可感到子宮腔內有胎囊滑過。胎囊在40d時才有球形感，直徑達3.5～4cm。但經產牛也常易錯判。妊娠60d后（三）直腸檢查法孕角大小為空角的2倍左右，波動感明顯，角間溝變得寬平，子宮向腹腔下垂，但依然能摸到整個子宮。60天時，子宮剛越過骨盆腔前緣。妊娠90d（三）直腸檢查法孕角的直徑長到10～12cm，波動極明顯；空角也增大1倍，角間溝消失，子宮開始沉向腹腔，初產牛下沉要晚些。子宮頸前移，有時能摸到胎兒。孕側的子宮動脈出現微弱的妊娠脈搏。子宮全部沉入腹腔，子宮頸越過恥骨前緣，一般只能摸到兩側的子宮角。子葉明顯，可摸到胎兒，孕側子宮動脈的妊娠脈搏已向下延伸，可能顯感到脈動。妊娠120d（三）直腸檢查法子宮膨大，沉入前腹腔區，子葉增長到胡桃核到雞蛋大小，子宮動脈增粗，達手指粗細。空角子宮也增粗，出現妊娠脈搏。子宮動脈沿薦骨前行，在薦骨與腰椎交界的岬部前方，可摸到主動脈的最后一個分支，稱髂內動脈。在左右兩根髂內動脈的根部，順子宮闊韌帶下行，可摸到子宮動脈。妊娠150d（三）直腸檢查法配種后第35～83d，乳汁孕酮含量達到35ng/ml以上可確定為妊娠。妊振母牛孕酮變化圖（四）乳汁孕酮測定法B超檢查對妊娠25d以上的牛可用B超檢查。

利用探頭通過直腸輕輕地在子宮角滑動，在熒光屏上便可觀察到周圍黑色中間有一個長1～2cm灰白色圖像，即是胎兒。胎兒60日齡時為6～7cm長，90日齡時為14～17cm長。（五）超聲波檢測法使用B超探頭檢查時要特別注意，防止動作過重，檢查過度，以免引起流產。（六）鞏膜血管診斷法母牛配種后20d，將牛保定，可以觀察到瞳孔正上方鞏膜表面有1～2條呈直線狀態（少數為彎曲）的縱向血管，顏色深紅、輪廓清晰，比正常血管要粗，直徑約為1mm，同時母牛也無發情表現，判斷為妊娠。

如果沒有妊娠，鞏膜表面無明顯血管暴露，血管細、顏色淡。小結：妊娠診斷是確定母牛配種后是否已經妊娠的一項技術。搞好妊娠診斷，可以防止母牛空懷，提高繁殖率，尤其是早期妊娠診斷更為重要，經妊娠診斷，如果已經妊娠的母牛，應加強飼養管理，保證胎兒的發育，維持母牛的健康；對未妊娠的母牛，及時檢查，找出未孕原因，采取相應的技術措施。思政融入：新生命的誕生來自母親的艱辛孕育，感恩母親。中國文化的特點之一是以母親為核心，以女性為紐帶的文化現象。例如地球母親，黃河母親和中國母親等，隨中國文化發展一直傳承至今。母親的言傳身教能讓子女受用一生，更多了一份對國家和人民的責任與擔當。3.人工輸精技術任務目標知識目標：能夠準確識別肉牛品種；掌握常見肉牛品種的經濟類型、外貌特征、生產性能。能力目標：能夠結合生產情況選擇適宜的肉牛品種；評價品種適應性。素質目標：認識中國肉牛品種與中國自主知識產權的重要性，品種是核心競爭力。小結目前全世界有60多個專門化的肉牛品種，按體型大小和產肉性能，大致可分為下列三大類中、小型早熟品種大型歐洲品種含瘤牛血液的品種任務目標知識目標：知道人工授精技術流程。能力目標：能對發情母牛進行人工授精操作。課程思政目標：培養學生實踐動手能力，認真的工作態度。為以后擔任牛場的繁殖工作打下基礎。人工授精技術顯著提高牛繁殖效率和后代生產性能。正如習主席所言“一粒種子可以改變一個世界，一項技術能夠創造一個奇跡”。引導和鼓勵學生掌握牛養殖新技術，強調牛養殖要插上科技的翅膀，實現提質增效的轉型升級，從數量規模型向質量智慧型轉變。養牛技術養牛技術人工輸精技術養牛技術主講人：姜明明（一）人工輸精技術人工授精技術仍然是動物生產領域應用最廣、普及率最高的動物繁殖技術。把人工授精技術稱為動物繁殖技術領域的“第一次革命”。（二）配種時機的掌握母牛發情開始約18h后接近發情結束或結束時是人工授精最佳時機。（三）牛的保定將待配母牛保定在六柱保定架內或在牛的畜床上輸精。（四）精液的準備用鑷子從液氮罐中取出細管冷凍精液，提取細管凍精時，注意細管凍精在液氮罐頸部停留不應超過10s，提筒停留的部位應在距罐口8cm以下處。從液氮罐取出細管凍精到投入水浴鍋或保溫杯的時間盡量控制在3s以內。直接將細管投入到30℃水浴鍋或盛有37℃溫水的保溫杯中，輕輕搖晃使細管中的冷凍精液完全融化。也可將細管冷凍精液投入40℃水浴環境中解凍3s左右，待有一半精液融化以后取出使其在室溫下完全融化。（四）精液的準備細管輸精器應將細管凍精解凍后，用專用剪刀剪去封口端約0.5cm，把細管專用輸精槍捅針向后拉10～15cm，將剪口端向前裝入輸精槍的前端。將輸精槍外套管的后端從塑料膜中推出塑料膜外，然后將外套管與輸精槍套在一起旋緊。輸精槍輸精套管鑷子細管剪長臂手套（四）精液的準備4.取出小提桶或紗布袋5.取出凍精6.解凍細管凍精7.后拉輸精槍槍芯1.準備好器材2.取出液氮罐蓋3.預冷長柄鑷子（四）精液的準備8.擦干水分9.檢查凍精信息10.剪封口11.裝槍12.旋緊套管（五）引導排糞及外陰部消毒將母牛的尾巴拉到一側，操作員站在牛的后方。用0.3%高錳酸鉀沖洗母牛的外陰、肛門，并用消毒紙巾將水分吸干，將外陰部及唇裂擦拭干凈。（六）輸精槍的插入左手壓開陰門裂，右手將輸精槍連同外套塑料膜呈45°角插入陰門內，進入約15cm左右后，左手拉住外套塑料膜向后拉，右手固定住輸精槍，使輸精槍從塑料膜中穿出，并使輸精槍的外套管推出塑料膜7～10cm。（七）直腸內的操作左手上涂以潤滑劑，先以手撫摸肛門周圍，再將手呈錐形伸入母牛的直腸中，使牛排出宿糞。然后將手向前伸，并將直腸向后扒，在骨盆腔內尋找子宮頸（手掌展平，向骨盆腔底部下壓，可找到一個棒狀物，質硬而且有彈性），找到后，手握子宮頸的外口處，并使子宮頸呈水平，向前推送。（八）輸精槍進入子宮頸管內及輸精右手將輸精槍向前推送，使輸精槍前端到達子宮頸陰道部。雙手配合，使輸精槍插入子宮頸口，當輸精槍進入子宮頸內時，能感覺到其通過子宮頸皺褶時“咔嘣、咔嘣”的“聲音”，輸精槍應隨著子宮頸管內的皺褶變化上下調整方向，直到向前推送時，沒有被皺褶阻擋的感覺時，說明輸精槍已經到達子宮體。這時應避免繼續向前推送。將輸精槍捅針緩緩向前推，將精液送入子宮體內。（八）輸精槍進入子宮頸管內及輸精注意事項：輸精槍向前推送時，應避免用蠻力，應不斷調整方向，使輸精槍輕松通過子宮頸管。如果在輸精槍未插入子宮頸管口時，母牛努責，應將子宮頸向前推送，使陰道壁伸直。如果不能確認輸精槍是否到達子宮體，為了避免輸精槍戳傷子宮粘膜，可在輸精槍在子宮頸管內通過4～5個皺褶時，就將精液輸入。將精液輸入時，應緩慢，以防倒流。（九）輸精次數一般情況下，發情母牛只需輸精一次即可，但如果輸精后8h內母牛仍有明顯的發情征狀，應在第一次輸精后8～10h進行第二次輸精。小結人工授精技術稱為動物繁殖技術領域的“第一次革命”，要嚴格按照工作流程執行。思政融入：大國工匠。2015年"五一"開始，央視新聞推出的系列節目。這系列節目講述了不同崗位勞動者用自己的靈巧雙手，匠心筑夢的故事。這群不平凡勞動者的成功之路，不是進名牌大學、拿耀眼文憑，而是默默堅守，孜孜以求，在平凡崗位上，追求職業技能的完美和極致。最終脫穎而出，躋身"國寶級"技工行列，成為一個領域不可或缺的人才。4.牛分娩與助產技術任務目標知識目標：能夠準確識別肉牛品種；掌握常見肉牛品種的經濟類型、外貌特征、生產性能。能力目標：能夠結合生產情況選擇適宜的肉牛品種；評價品種適應性。素質目標：認識中國肉牛品種與中國自主知識產權的重要性，品種是核心競爭力。小結目前全世界有60多個專門化的肉牛品種，按體型大小和產肉性能，大致可分為下列三大類中、小型早熟品種大型歐洲品種含瘤牛血液的品種【任務目標】知識目標：掌握母牛分娩征兆，熟悉牛接產方法。能力目標：能做好母牛接產和產后護理工作。課程思政目標：新生命的誕生來自母親的艱辛孕育，感恩母親。中國文化的特點之一是以母親為核心，以女性為紐帶的文化現象。例如地球母親，黃河母親和中國母親等，隨中國文化發展一直傳承至今。母親的言傳身教能讓子女受用一生，更多了一份對國家和人民的責任與擔當。養牛技術養牛技術牛分娩與助產技術養牛技術主講人：姜明明牛預產期按“月減3，日加6”（按280d計算）來推算。即母牛配種月份減3，配種日加6，即是預產日期。若配種月份在1、2、3月不夠減時，則需借1年（即加上12個月）再減。如果配種日加6超過1個月時，則需減去本月實際天數，日數按剩余日數計算，同時在月份上加1。預產期的推算案例某牛2021年4月28日配種受胎，預產期為：月份：4－3＝1（月）天數：28＋6＝34（日），減去1月的31d，即34－31＝3（日）月份進一個月，即1＋1＝2（月）即該牛的預產期是2022年2月3日。預產期的推算母牛在分娩前，在生理和行為上均發生顯著的變化，根據機體的一系列變化，準確判斷分娩時間，以便做好接產工作。分娩預兆乳房變化對于待產母牛，分娩前半個月，母牛乳房明顯膨大，有的還并發水腫；在產前10d，乳頭表面有蠟狀光澤；在產前1～3d，乳房明顯增大，乳頭直立，可擠出乳來，若奶由乳白色、稀薄變得黃色而濃稠時，就快分娩了，當出現漏乳現象后，數小時至一天左右即分娩。分娩預兆外陰部變化產前數天到1周左右，外陰部明顯腫脹且不緊閉，母牛陰唇逐漸變松軟，腫脹并體積增大，陰唇皮膚皺褶展平，并充血稍變紅，封閉子宮頸口的膠狀黏液溶化，在分娩前1～2d，從陰道流出黏液由濃稠變稀薄。分娩預兆臨產前骨盆韌帶松弛，臀部有塌陷現象，肷窩明顯下陷，骨盆腔在分娩時稍增大，這是臨產的主要征狀薦髂韌帶也同樣變得很軟分娩預兆骨盆韌帶的變化行為變化臨分娩時，母牛表現精神不安，起臥不定，有時用蹄刨地，頻頻排尿，不斷回顧腹部，母牛開始發生陣縮，說明即將分娩。分娩預兆開口期子宮開口期也稱宮頸開張期，指從子宮開始間歇性收縮起，到子宮頸口完全開口，與陰道之間的界限完全消失為止。由于子宮肌開始出現陣縮，陣縮時將胎兒和胎水推入子宮頸，使子宮頸口充分開張，這一時期僅有陣縮，沒有努責。母牛這時表現起臥不安，脈搏、呼吸加快，食欲減退，轉圈刨地，即將分娩。一般情況下，牛開口期持續時間為0.5～24h、羊開口期持續時間為3～7h。此時，接產人員要守候，不能離開。分娩過程胎兒產出期在這個時期，陣縮和努責同時進行，共同作用，努責是排出胎兒的主要動力，母牛表現極度不安，腹痛，腹內壓顯著升高，回顧腹部，弓背努責，此時應準備接產。牛持續3～4h。產雙胎間隔20～120min。分娩過程胎兒產出期指從子宮頸完全開張到胎兒全部產出為止。胎衣排出期胎衣排出期指從胎兒排出后起，到胎衣完全排出為止。胎兒產出后，母牛安靜下來，間隔片刻，子宮肌又重新開始收縮，同時也伴有努責，直到胎衣完全排出為止。持續時間為2～8h，超過12h為胎衣不下。分娩過程接產工作是牛繁殖中的一項重要工作，直接關系到母仔生命的安危及產后疾病的預防，助產不當或沒有及時助產，會給生產和經濟上帶來損失，因此，在產前作好準備工作非常重要。助產技術產前的準備工作助產技術產前的準備工作（1）產房及用具的準備在產前3～5天，必須對產房、運動場、飼草架、飼槽、分娩欄等進行修理和清掃，并進行徹底的消毒。消毒后的產房應做到地面干燥、光線充足、空氣新鮮、擋風御寒。應在產房內準備好清潔的盆、桶等用具及毛巾、刷子、繃帶、產科繩、剪刀、體溫計、聽診器、注射器等器械，有條件的最好準備一套產科器械。產前的準備工作（1）產房及用具的準備助產技術應為產仔的母牛準備充足的青干草、質地優良的農作物秸稈、多汁飼料和適當的精料等，以保證其營養平衡和充足。助產技術產前的準備工作（2）飼草、飼料的準備（3）助產人員的準備助產技術產前的準備工作要求助產人員堅守崗位，認真負責地完成自己的工作任務，杜絕一切責任事故發生。對所有參加助產的工作人員，應具備接產的基本知識和獸醫技術，以便發現問題及時處理。產房內應具備消毒藥（如0.1%新潔爾滅、70%酒精、碘酒等）、強心劑、催產素、止血敏等藥物，從而保證接產的順利進行。（4）藥品的準備產前的準備工作助產技術分娩時胎兒的姿勢、方向和位置正常與否，是決定能否順利產出的關鍵。因此，接產人員正確判斷胎兒的胎向、胎位及胎勢至關重要。助產技術判斷胎向、胎位及胎勢表示胎兒的方向，也就是胎兒脊柱與母體脊柱的關系。胎向一般分為縱向、橫向和豎向三種。縱向為胎兒脊柱與母體脊柱相平行，為分娩的正常方向；而橫向和豎向分別為胎兒脊柱與母體脊柱呈水平垂直和上下垂直，屬于分娩的不正常胎向。助產技術判斷胎向、胎位及胎勢（1）胎向表示胎兒在母體內的位置關系，也就是胎兒背部和母體背部的相互關系。助產技術判斷胎向、胎位及胎勢（2）胎位胎兒的背部向著母體的薦骨，為正常的胎位胎兒的背部向著母體的下腹壁，這是分娩的不正常胎位胎兒的背部向著母體的一側的腹壁，這種胎位若斜度不大，算作正常胎位，若斜度過大，為不正常胎位上位下位側位表示胎兒的姿勢，一般可分為伸展和彎曲兩種姿勢。為了防止發生難產，特別是對于大家畜母牛來說，更應把預防難產放在首位。當胎兒先露部分進入產道時，就應先進行胎兒的方向、位置及姿勢的確定，以便對胎兒的反常及早做出診斷。及早發現和矯正不但容易克服難產，甚至還能救活胎兒。助產技術判斷胎向、胎位及胎勢（3）胎勢接產應在嚴格遵守消毒的原則下，按照正確的步驟和方法進行，以保證胎兒順利產出和母牛的安全。自然產出助產技術接產時，當胎膜露于陰門時，助產者將消毒并涂有潤滑劑的手臂伸入產道，隔著胎膜觸摸胎兒，來判斷胎向、胎位和胎勢是否正常。自然產出檢查母牛的硬、軟產道的情況，包括骨盆有無變形，陰門、陰道及子宮頸的松軟擴張程度，以判斷有無因產道反常而發生難產的可能。助產技術當胎兒唇部或頭部露出陰門外時，如果上面有羊膜，可把它撕破，并把胎兒的鼻孔內的黏液擦凈，以利于其呼吸。當羊水流出時，最好用容器接住，產后喂給母牛3～4kg，可以預防胎衣不下的發生。與此同時，母牛努責及陣縮加劇，胎兒的兩前肢伸出，隨后是頭、軀干和后肢產出。這屬于正常的順產，助產人員只要稍加幫助即可。自然產出助產技術正常分娩是胎兒兩前腳夾著頭先出來，這屬于正常胎位，一般以自然產出為原則；如破水時間長或胎兒露出時間較長，而母牛努責微弱，則要抓住兩前肢，并用力拉出胎兒。倒生時更應及早拉出。自然產出助產技術拉出胎頭時，要捂住陰唇及會陰，避免撐破。胎頭拉出后，應放慢動作，以免子宮內翻或脫出。正常產出一般需要0.5～4h。自然產出助產技術小結：通過本節課的學習能對配種后母牛及早地作出診斷，掌握母牛妊娠、分娩征兆，熟悉牛妊娠檢查及接產方法。能正確進行牛妊娠診斷，做好母牛接產和產后護理工作。思政融入：社會主義核心價值觀以“三個倡導”為基本內容，即“倡導富強、民主、文明、和諧，倡導自由、平等、公正、法治，倡導愛國、敬業、誠信、友善”。其中，“富強、民主、文明、和諧是國家層面的價值目標，自由、平等、公正、法治是社會層面的價值取向，愛國、敬業、誠信、友善是公民個人層面的價值準則”。社會主義核心價值觀回答了我們要建設什么樣的國家、構建什么樣的社會、培育什么樣的公民的重大問題。5.奶牛發情鑒定任務目標知識目標：能夠準確識別肉牛品種；掌握常見肉牛品種的經濟類型、外貌特征、生產性能。能力目標：能夠結合生產情況選擇適宜的肉牛品種；評價品種適應性。素質目標：認識中國肉牛品種與中國自主知識產權的重要性，品種是核心競爭力。小結目前全世界有60多個專門化的肉牛品種，按體型大小和產肉性能，大致可分為下列三大類中、小型早熟品種大型歐洲品種含瘤牛血液的品種【任務目標】知識目標：掌握牛發情鑒定方法。能力目標：掌握發情鑒定技術。課程思政目標：培養學生實踐動手能力，認真的工作態度。為以后擔任牛場的繁殖工作打下基礎。發情鑒定技術是人工授精技術的基礎。正如習主席所言“一粒種子可以改變一個世界，一項技術能夠創造一個奇跡”。引導和鼓勵學生掌握牛養殖新技術，強調牛養殖要插上科技的翅膀，實現提質增效的轉型升級，從數量規模型向質量智慧型轉變。養牛技術養牛技術牛發情鑒定技術養牛技術主講人：姜明明牛發情鑒定技術在發情期間，母牛由于受到體內生殖激素，特別是雌激素的作用，90%-95%的健康母牛具有正常的發情周期和明顯的發情表現。母牛的發情通常可采用行為觀察、生殖道變化以及直腸觸摸卵巢等途徑進行鑒定。牛發情鑒定技術在牛場的繁殖工作中，發情鑒定是一個重要的技術環節，通過發情鑒定可以判斷母牛是否發情，確定適宜的配種時間，從而提高母牛的受胎率。01020304外部觀察法直腸檢查法陰道檢查法涂蠟筆法目錄05計步器識別法01外部觀察法外部觀察法發情征狀相互爬跨是牛發情的典型征狀。發情牛接受爬跨，發情初期母牛發情時常有公牛或其他母牛跟隨爬跨，并且爬跨其他母牛，初期時并不接受爬跨。外部觀察法發情征狀相互爬跨是牛發情的典型征狀。發情牛接受爬跨，發情初期母牛發情時常有公牛或其他母牛跟隨爬跨，并且爬跨其他母牛，初期時并不接受爬跨。外部觀察法發情征狀發情盛期發情的母牛表現接受爬跨，被爬跨時站立不動，兩后肢叉開舉尾。發情末期，母牛拒絕公牛接近和爬跨，但有時也爬跨其他牛，在末期時可觀察到母牛尾根和尾骨被摩擦過，在身體背部兩側有被爬跨的印跡，被毛蓬亂，證明已經接受過爬跨。根據發情周期預判即將發情牛開始對發情牛感興趣，但不接受爬跨。外部觀察法生殖道變化發情初期外陰部充血，微腫。陰道間斷地排出黏液，透明、量少而稀薄。發情盛期陰戶腫脹。陰道黏液多而濃稠，呈牽絲狀。發情末期陰戶腫脹減退，陰道黏液混濁，呈乳白色，量少黏稠，有干燥黏液附于尾部。外部觀察法生殖道變化發情母牛子宮頸外口略開張，陰道前庭粘膜紅腫，有強光澤和滑潤感，陰戶腫脹，濕潤，排出的粘液牽縷性強，并垂于陰門之外，俗稱“吊線”。外部觀察法行為變化發情初期食欲不佳，精神不安，左顧右盼，常站立不臥，有幾聲鳴叫。發情盛期食欲差，精神不安，走動頻繁，不停鳴叫，交配欲強烈。發情末期母牛逐漸轉入安靜。與其他牛額對額地相對立發情母牛鳴叫發情母牛常作排尿姿勢，尾根經常舉起或搖尾。外部觀察法放入運動場后，追逐并爬跨其他牛。同性性行為增多。發情母牛安靜接受其他牛嗅其外陰和爬跨，人觸及其外陰，舉尾不拒。性行為外部觀察法多數牛在自由活動，個別牛躺臥休息。被爬跨痕跡，被毛凌亂，黏液粘結。身體呈蒸騰狀，尤其在天氣較冷的時候。發情黏液帶血絲，粘附在外陰部。剛結束發情牛的判斷方法：02直腸檢查法直腸檢查法伸入直腸尋找角間溝觸摸卵巢觸摸卵泡在對牛進行直腸檢查時，檢查者將手伸進直腸，然后尋找卵巢，觸摸卵泡的變化情況。直腸檢查法伸入直腸尋找角間溝觸摸卵巢觸摸卵泡先將手伸入骨盆腔上方位置，將手掌伸平，掌心向下，手指輕輕左右撫摸，在骨盆腔底正中可以觸摸到子宮頸；然后順著子宮頸向前移動，可以觸摸到較軟的子宮體和角間溝，在稍向前子宮角間溝的兩旁各有一條向前向下彎曲的管狀物即左右兩側子宮角。直腸檢查法伸入直腸尋找角間溝觸摸卵巢觸摸卵泡沿著子宮角大彎至子宮角尖端外側即可摸到卵巢。可以觸摸卵巢的大小、形狀、彈性和卵泡的發育情況。摸完一側卵巢后，再將手移到另一側卵巢，以同樣方法觸摸。在操作中發現母牛努責或過于擴張，應停止檢查，注意動作要輕，防止捏碎卵泡。直腸檢查法卵巢體積稍為增大，卵泡的體積為0.5～0.75cm，觸之能感覺到卵巢上有一個軟化點。這一期持續約10h。母牛開始出現發情的外表征狀。根據卵泡發育情況可將母牛卵泡發育分為四個時期第一期（卵泡出現期）直腸檢查法卵泡直徑1～1.5cm，呈小球狀波動明顯。這一期持續10～12h。第二期（卵泡發育期）直腸檢查法卵泡體積不再增大，但卵泡壁變薄，緊張性增強，有一觸即破的感覺。這一期持續6～8h。此期母牛的發情征狀明顯。第三期（卵泡成熟期）直腸檢查法母牛性興奮消失后10～15h卵泡開始破裂，泡液流失，泡壁變為松軟，呈一凹陷。排卵后6～8h紅體形成，觸感柔軟，凹陷不明顯。直徑0.5～0.8cm，這時母牛即進入休情期。排卵多發生于性欲結束后10-15小時。第四期（排卵期）03陰道檢查法陰道檢查法

陰道檢查法是將陰道開膣器插入母牛陰道，借助一定光源，觀察母牛陰道黏液的色澤、黏液性狀及子宮頸口開張情況，判斷母牛發情程度的方法。陰道檢查法用一手拇指和食指（或中指）將陰唇分開，另一手持開膣器把柄，使開膣器呈閉合狀態斜向前上方插入陰門。當開膣器的前1/3進入陰門后，即改成水平方向插入陰道，同時慢慢旋轉打開開膣器，使其把柄向下，借助手電筒觀察陰道黏膜的顏色、子宮頸口開張情況及有無黏液蓄積等。檢查完將開膣器稍微合攏，輕輕轉動手柄，確認無黏膜夾入，再將開膣器拉出。具體操作方法陰道檢查法結果判定未發情母牛：陰門緊縮，陰道黏膜干澀，開膣器伸入時阻力較大，黏膜顏色蒼白或微黃，子宮頸口關閉。發情母牛：開膣器插入比較順暢，陰道黏膜潮紅、濕潤，陰道內有黏液蓄積或流出，子宮頸口腫脹，呈“菊花”瓣狀。陰道檢查法檢查時，消毒要嚴格，操作要仔細，防止粗暴。由于該法不能準確地判斷母牛的排卵時間，因此，目前只作為一種輔助性檢查方法。注意事項04涂蠟筆法涂蠟筆法檢測人員站在牛的后面，最好是側對牛只，保持一定的距離，謹防被踢。每天堅持對牛只涂蠟筆，每天1～2次，以早晨為佳。正確的涂抹部位為尾椎上面，從尾部到十字部，長約30～40cm。第一次涂時，需反復涂3～4次，之后只需要反復1～2次以補充顏料，使其保持新鮮。對于鑒定為發情的牛只，在尻部兩側標記當天的日期，做好記錄和標記。涂蠟筆法重點是觀察和區別被爬跨和未被爬跨牛只尾部所涂蠟筆染料的區別。發情母牛接受了其他母牛爬跨，尾部毛發被壓，上面的蠟筆涂料被摩擦掉，或者被其他母牛腹部黏附的牛糞污染，顏色變淺、變深。未發情母牛不接受其他母牛爬跨，尾部毛發未被壓，所以保持直立或高聳，上面的蠟筆涂料保持新鮮，與新涂抹的保持一致。05計步器識別法計步器識別法

計步器識別法是通過對母牛運動量的監測輔助鑒定發情母牛，這是基于發情動物的運動量要顯著高于未發情動物的原理。計步器識別法計步器采用全封閉設計，防水防潮，可以在泥濘或積水的牛場環境下工作。其傳感器內部電路采用超低功耗設計，電池采用高性能高容量鋰電池，可保證傳感器正常工作五年以上。系統靈敏度高，傳感器識讀率高，發情檢測準確。計步器識別法該系統安裝簡單，僅需將計步器佩戴到母牛腿部即可，無需任何后續操作，不增加牧場任何工作量，系統會根據每天的活動量自動判斷母牛的發情狀態。這將大大簡化牛場繁殖人員的工作，能節省出40％的時間去處理其他工作，而不是花費在觀察母牛是否發情上。小結外部觀察法是常用的方法，但是工作量大，會出現遺漏現象；直腸檢查法對技術水平要求較高；陰道檢查實踐應用并不多；涂蠟筆法是牧場采用較多的方法；計步器識別法在現代化奶牛場使用較多。思政融入：實踐動手能力，認真的工作態度將為以后擔任牛場的繁殖工作打下基礎。發情鑒定技術是人工授精技術的基礎。正如習主席所言“一粒種子可以改變一個世界，一項技術能夠創造一個奇跡”。掌握牛繁殖新技術，給牛繁殖要插上科技的翅膀，實現提質增效的轉型升級，從數量規模型向質量智慧型轉變6.繁殖新技術任務目標知識目標：能夠準確識別肉牛品種；掌握常見肉牛品種的經濟類型、外貌特征、生產性能。能力目標：能夠結合生產情況選擇適宜的肉牛品種；評價品種適應性。素質目標：認識中國肉牛品種與中國自主知識產權的重要性，品種是核心競爭力。小結目前全世界有60多個專門化的肉牛品種，按體型大小和產肉性能，大致可分為下列三大類中、小型早熟品種大型歐洲品種含瘤牛血液的品種5.動物克隆(animalcloning)：利用無性繁殖的方式產生一系列遺傳物質完全相同動物的過程。6.胚胎細胞(embryoniccell)：胚胎卵裂球細胞或內細胞團細胞。7.胚胎干細胞(embryonicstemcell)：從胚胎內細胞團或原始生殖腺分離出來的能在體外無限增殖且具有全能性的細胞。

8.細胞全能性(celltotipotency)：細胞所具有的由一種細胞分化形成生物所有的組織細胞（包括生殖腺在內）的能力。9.細胞多能性(cellmultipotency)：細胞所具有的由一種細胞分化形成兩種或兩種以上細胞或組織的特性。（二）利用胚胎分割法克隆動物(Cloninganimalbyembryosplitting)1．用胚胎分割法克隆動物基本概念（basicconcept）：就是利用機械分割的方法將一個胚胎分割為若干等份，使分割的胚胎都能發育成個體的過程。2、操作程序：

2.基本程序（basicprogram）（1）準備切割器具(prepareinstrumentortool)：顯微操作儀、體視顯微鏡、倒置顯微鏡、胚胎固定管和分割針（2）處理胚胎(dealwithEmbryo)：將胚胎用鏈霉蛋白酶處理，軟化透明帶。（3）分割胚胎(splittingEmbryo)：用機械切割法（刀，針）將胚胎內細胞團或卵裂球分割為若干部分（4）移植細胞于透明帶內(transferembryoniccellintopellucidzone)：將多個卵裂球細胞或內細胞團細胞移植入去胚胎細胞的透明帶中。

（5）培養胚胎(cultureembryos)：采用受體培養法或體外培養法培養胚胎。受體培養法就是將胚胎放在動物輸卵管或子宮角，利用動物體內條件培養胚胎。（6）移植胚胎(transferembryos)：將分割胚胎移植給經同期發情處理的受體動物的子宮角或輸卵內。（7）受體動物妊娠和分娩（Thepregnancyofreceptorandparturition）：移植的克隆胚胎在受體動物體內發育，形成克隆動物。

3.胚胎分割法克隆動物研究進展（progressonanimalcloningbysplittingembryo）（1）1904年，Spemann將蛙的胚胎進行分割，獲得了同胚雙生后代。（2）1930年，Pinus將兔子的單個2-細胞卵裂球培養成為體積較小的亞囊胚。（3）1970年，Mullen分離小鼠2-細胞胚胎卵裂球，獲得同卵雙生后代。（4）1978年，Moustafa將小鼠桑椹胚分割，獲得同卵雙生后代（5）80年代，Willadsen對綿羊早期胚胎進行分割，獲得四分之一、八分之一分割胚胎后代。（6）1986年，由竇忠英教授完成的我國第一個胚胎分割牛在西北農業大學誕生（四分胚）。（7）1988年，由張涌教授完成的我國第一個胚胎分割二分胚小鼠在西北農業大學誕生。目前已有豬、馬、牛、羊、兔、小鼠、人分割胚后代。

4．胚胎分割克隆動物的意義（Thefunctionofcloninganimal）（1）提高胚胎利用率，充分發揮母畜繁殖潛力（2）獲得遺傳基礎同一的個體，為利用后裔評價種畜育種值提供實驗材料（3）為胚胎性別鑒定提供材料。（4）為轉基因胚胎的鑒定提供實驗材料（5）為藥物和飼料營養價值的評定提供實驗材料，消除遺傳因素對實驗結果的影響。5．目前存在的問題（Theproblemofanimalcloningbysplittingembryosatpresent）（1）初生重低（Lowofbirthweight）（2）遺傳一致性（geneticidentical）（3）所獲克隆動物數量少（afewofcloneanimalbysplittingembryo）

（4）先天性畸形，發育不良（三）用細胞核移植克隆動物（cloninganimalbycellnucleartransplantation）1.細胞核移植是指利用顯微操作技術將一種動物細胞移入同種或異種動物的去核成熟卵母細胞內，形成核質雜種新細胞。并通過激活，融合，形成胚胎的過程。2.細胞核移植的意義（1）大幅度提高良種動物繁殖效率分割或消化早期胚胎進行移植，能克隆多個子代個體；（2）為外源基因導入細胞（或基因敲除）創造條件；研究基因的功能。（3）為進一步研究細胞核質關系奠定基礎；（4）加速動物育種進程避免自然條件下選種動物育種周期長和生育效率低的限制。（5）為動物遺傳資源保存提供支撐1）保存細胞就等于保存個體。2）搶救瀕危動物（6）用于動物生長發育規律的研究（7）為動物科學、人類醫學發展提供同源性實驗材料。

（8）為生產轉基因動物提供技術支持，利用轉基因動物作生物反應器，增加產品數量，提高產品質量，創造新產品，提高畜牧業的生產效率。3.細胞核移植克隆動物技術核質融合與激活胚胎細胞分離妊娠產仔卵母細胞成熟培養胚胎移植卵母細胞去核去核卵母細胞重構細胞胚胎培養細胞核移植克隆動物胚胎4.細胞核移植發展史（1）德國胚胎學家漢斯.施佩曼博士首先提出細胞核移植試驗；（2）1952年，美國人羅伯特.布里格斯等利用蛙卵建立了細胞核移植技術，1955年，將豹蛙囊胚細胞核移入去核卵母細胞中，細胞發育為蝌蚪，部分成為成體蛙；（3）1977年，美國杰克遜培育出7只單親小鼠；1981年，瑞士卡爾.伊爾門澤等首次進行小鼠核移植成功；（4）1997年，英國威爾姆特獲得世界上首例體細胞克隆羊“Dolly”國內：（1）1961年，中科院童第周等首次成功進行了魚類不同亞科間核移植；（2）1980年，中國科學院武漢水生生物所獲得鯽魚核移植幼魚；（3）1989年，中科院童第周等首次獲得核質雜交“鯉鯽核魚”；（4）1990年，西北農林科技大學首次獲得體細胞核移植山羊。目前，我國的核移植研究基本與世界水平接近，許多留學生以第一作者在Nature、Science、PNAS等頂級雜志已發表相關研究論文數十篇。5．用于細胞核移植全能性供體細胞（Thedonortotipotencycellforcellnucleartransplantation）（1）胚胎細胞(embryoniccell)（2）胚胎干細胞(embryonicstemcell)（3）內細胞團細胞(innercellmasscell)（4）原始生殖細胞(primarygermcell)

6．用于細胞核移植的非全能性細胞（1）皮膚上皮細胞(epitheliacell)（2）成纖維細胞(fibroblasticcell)（3）顆粒細胞(cumuluscell)（4）乳腺上皮細胞(mammaryepitheliacell)（5）神經細胞（nervecell）7．細胞核移植克隆動物的分類（ThetypeofcloneAnimalbycellnucleartransplantation）（1）體細胞核移植克隆動物（Cloneanimalbysomaticcellnucleartransplantation）（2）胚胎細胞核移植克隆動物（Cloneanimalbyembryoniccellnucleartransplantation）（3）胚胎干細胞核移植克隆動物（Cloneanimalbyembryonicstemcellnucleartransplantation）（4）內細胞團核移植克隆動物（Cloneanimalbyinnercellmasscellnuclear

）8.細胞核移植克隆動物的技術要點（Thekeymethordofanimalcloningbycellnucleartransplantation）（1）分離和培養供體細胞（separatingandculturingdonorcell）（2）獲取卵母細胞（Obtainoocyte）（3）體外培養卵母細胞（oocyteculturinginvitro）處理供體細胞(dealwithdonorcell)（4）卵母細胞去核(removeoocytenuclear)（5）將供體細胞注射入去核卵母細胞中

transplantationdonorcellintooocyteremovednuclear（6）融合與激活（syncretizeandactivation）（7）克隆胚胎培養（cloneembryocultureinvitro）（8）胚胎移植(embryostransplantation)（9）生產克隆動物(producecloneanimal)

9.細胞核移植方法（胚胎細胞核移植為例）（1）概念：將未著床的早期胚胎分割或消化分散為單個細胞，并將其注射入去核卵母細胞，使其與去核（染色體）的卵母細胞融合，體外發育成早期胚胎后，移入受體產生后代的技術，稱為胚胎細胞核移植。因為是無性繁殖，又稱克隆。（2）技術路線

收集卵母細胞早期胚胎體外培養卵母細胞體外成熟胚胎分割或離散獲得胚胎細胞注入卵母細胞去核核移植胚胎體外培養移植產生核移植后代（3）方法（以牛卵母細胞核移植為例）

①牛卵母細胞的體外成熟培養

A.獲取卵母細胞

采牛、羊卵巢，放入37℃含雙抗生理鹽水中,6h內運回實驗室。用35～37℃的加有雙抗滅菌生理鹽水清洗卵巢3次,用注射器吸卵巢表面直徑為2～5mm卵泡的卵泡液。將抽吸物緩慢注入檢卵杯中,靜置,檢卵。B.篩選卵丘卵母細胞復合體將檢出卵丘卵母細胞復合體分級。A級：顆粒細胞層完整且緊密,一般為4～6層,胞質均勻；B級：顆粒細胞層較少,一般為2～4層,胞質均勻；C級：顆粒細胞層不全或為裸卵。只選擇A，B級卵丘卵母細胞復合體用于成熟培養。C.卵母細胞成熟培養

牛卵母細胞成熟培養條件為5%CO2，39℃，飽和濕度。成熟培養前2h制作微滴，上蓋石蠟油后置CO2培養箱中平衡。用培養液對牛卵母細胞進行成熟培養D.卵母細胞成熟鑒定將培養19～22h的牛卵母細胞分別用D-hank液清洗3遍,放入含有0.3%透明質酸酶的D-hank液內,培養箱中孵育10min，用150μm的毛細玻璃管輕輕吹打以除去顆粒細胞,鏡檢裸卵母細胞。如果出現第一極體說明卵母細胞已培養成熟，可以進行顯微操作。②供體細胞準備采用顯微切割或胰酶消化的方法，將囊胚期前的胚胎分成幾份或成單個胚胎細胞。③卵母細胞去核顯微操作，盡可能將卵母細胞核去掉。去核操作后，培養箱內孵育30min，形態結構完整者用于構建克隆胚胎。⑤重構胚激活將胚胎細胞直接注射入去核卵母細胞后，將其復合體移入M199中洗三次，CO2培養箱中培養30min，待成熟24~26時用化學方法激活重構胚。⑥重構胚體外培養將活化的重構胚放入培養液中，在38.5℃，5％CO2，飽和濕度的培養箱中培養。48h后觀察卵裂情況。⑦重構胚移植通過非手術的方法，將發育到桑椹胚或囊胚的重構胚（桑葚胚或囊胚）移入到受體母牛子宮，使妊娠，產犢。（受體母牛處于排卵后第7，8天）。體外重構胚發育情況10.體細胞核移植（1）概念分離組織成單個細胞，將單個體細胞注射入去核卵母細胞中，并通過激活、融合使其分裂、發育形成早期胚胎代的技術，稱為體細胞核移植。（2）技術路線

收集卵母細胞組織卵母細胞體外成熟消化離散為單個細胞注射卵母細胞去核培養細胞外源基因轉染細胞

核移植胚胎體外培養移植產生核移植后代（3）方法

卵母細胞的獲取：同胚胎細胞核移植卵母細胞的成熟培養：同胚胎細胞核移植供體細胞的獲取：采用酶消化的方法，從組織中獲取單個的結構完整的細胞，作供體細胞。卵母細胞去核：同胚胎細胞核移植細胞核移植：同胚胎細胞核移植激活、融合：同胚胎細胞核移植早期胚胎的培養：同胚胎細胞核移植胚胎移植：同胚胎細胞核移植11.動物克隆存在的問題（theproblemofanimalcloningbycellnucleartransplantation）（1）技術尚不成熟，成功率低目前所得到的克隆動物具有極大的偶然性和隨機性，技術尚不成熟。如，共克隆綿羊胚胎277，獲得1個“Dolly”。（2）死亡率和疾病率高由于是無性繁殖，克隆后代一些隱性有害基因更易顯性，壽命、疾病易嚴重發生。如，“Dolly”僅活5，且患嚴重關節炎。在操作過程中，可能對細胞造成潛在的危害。（3）有性繁殖是自然進化的結果，克隆是否本身就是倒退？（4）人的克隆有背于社會學和倫理學利用胚胎干細胞核移植生產轉基因動物示意圖利用胚胎干細胞核移植生產轉基因動物示意圖二、動物胚胎干細胞與組織干細胞（一）干細胞1.概念干細胞（stemcell,SC)是一類具有無限自我更新能力的細胞，能夠產生至少一種類型的、高度分化的子代細胞，能在體外大量擴增、凍存而不失其原有特性。2.分類

（1）根據發生學來源分為以下兩大類：

胚胎干細胞：是從早期胚胎內細胞團或原始生殖細胞經體外分化抑制培養篩選分離出來的具有發育全能性的細胞。它既可以象其它細胞一樣在體外培養、增值、冷凍、保存、操作和篩選，又可通過嵌合或核移植參與各種組織的發育，形成克隆動物。

成體干細胞：是存在于一種已經分化組織中的未分化細胞，這種細胞能夠自我更新且能特化形成組成該類型組織的細胞。目前發現的成體干細胞主要有：造血干細胞、骨髓間充質干細胞、神經干細胞、胰腺干細胞等（2）根據干細胞分化的潛能大小分類全能干細胞：具有自我更新和分化成任何類型細胞的能力，有形成完整個體的分化潛能，如胚胎干細胞。多能干細胞：具有具有自我更新和產生多種類型細胞的能力，但卻喪失了發育成完整個體的能力，發育潛能受到一定的限制。如存在于骨髓的造血干細胞科分化出至少12種血細胞。

單能干細胞：具有自我更新能力，只能向單一方向分化，產生一種類型細胞。如雞肉中的成纖維細胞等。（3）還可以根據干細胞存在的部位分類：如胚胎干細胞、造血干細胞、成骨干細胞、神經干細胞、皮膚干細胞、胰腺干細胞、精原干細胞3.干細胞工程（1）定義：體外分離培養干細胞，并對其進行各種操作的工藝體系，其目的是研究其生物學特性，應用于基礎研究和臨床治療。（2）研究范圍：1）分離、純化、克隆、保存干細胞，建立干細胞系；2）研究干細胞的生物學特性，如形態、生長、表達、分化等特性與規律；3）借助干細胞，研究細胞分化形成組織及發育生物學問題；4）干細胞與轉基因；5）臨床應用，治療疾病4.干細胞的應用前景（1）作為細胞治療、組織器官替代治療的種子細胞；（2）揭示人和動物發育過程中的發育機制及有關影響因素；（3）利用胚胎干細胞克隆動物，提高繁殖效率，保存稀有動物遺傳資源，創造新物種；（4）為藥物篩選、藥理研究及新藥開發建立平臺；（5）建立各種實驗動物模型（6）生產轉基因動物的有力工具。（7）研究基因功能的有力工具。（二）動物胚胎干細胞1.概念與特性（1）.胚胎干細胞(embryonicstemcell)概念：從胚胎內細胞團或原始生殖腺分離出來的能在體外無限增殖且具有全能性的細胞。（2）胚胎干細胞的特性①.細胞全能性(celltotipotency)：細胞所具有的由一種細胞分化形成生物所有的組織細胞（包括生殖腺在內）的能力。②.具有無限增殖的能力2.胚胎干細胞的分離與培養的技術路線胚胎干細胞建系的方法很多，主要包括以下幾種：（1）從胚胎的囊胚期內細胞團中直接分離胚胎干細胞技術路線：培養胚胎分離出內細胞團離散細胞團形成多個細胞的集落接種在小鼠成纖維細胞飼養層上或也只分化的培養液中---培養，使細胞生長挑出未分化單克隆細胞團離散單個或多個細胞再接種培養、擴增。從胚胎內細胞團分離胚胎干細胞示意圖（2）從原始生殖細胞分離和培養胚胎干細胞技術路線：消化人胚胎原始生殖脊---分離出原始生殖細胞接種于小鼠成纖維細胞滋養層上生長----挑出未分化單克隆細胞團-----離散------再接種擴增。（3）利用細胞核移植胚胎分離胚胎干細胞：將成體組織細胞或胚胎細胞、胚胎干細胞注射入去核卵母細胞-----激活，融合---體外培養形成早期胚胎----體外培養成囊胚----消化內細胞團----分離出內細胞團細胞----接種于成纖維細胞飼養層培養---胚胎干細胞集落----挑出未分化單克隆細胞團----離散-----再接種擴增。從核移植胚胎中獲取胚胎干細胞3.動物胚胎干細胞分離與克隆方法(1)飼養層制備選擇妊娠12-16日齡昆明系小白鼠胎兒制備原代小鼠胎兒成纖維細胞，

①小鼠胎兒的獲取與處理斷頸處死妊娠母鼠，用75%酒精消毒腹部，用外科手術器械無菌取出胎兒，置于無鈣鎂PBS中，去除頭、四肢及內臟，用無鈣鎂PBS洗滌3～5次，去除血液，再用眼科剪剪碎胎兒組織備用。②小鼠胎兒成纖維細胞的制備將小鼠胎兒組織置于三角瓶中,加入2-5ml0.25%Trypsin+0.04%EDTA,室溫磁力攪拌器攪拌10-30分鐘,將組織消化為糊狀,加入3-7ml培養液終止消化,用無菌濾紗將細胞過濾于15ml離心管中,3000rpm離心5分鐘,棄去上清液,加入1-2ml培養液,用移液管輕輕吹打細胞團,使細胞離散.再加入5ml培養液,使細胞懸浮,1000轉/分鐘離心5分鐘.棄上清液,③細胞計數準確加入適量細胞培養液,懸浮細胞,取少量細胞懸浮液,按常規法計數④接種細胞:取適量細胞,接種于含有細胞培養液的培養皿中,2-3天換一次細胞培養液.⑤細胞培養:在37℃,飽和濕度,5%CO2中培養.⑥成纖維細胞飼養層制備將鋪滿皿底的成纖維細胞培養皿中的培養液移去，加入含1μg/ml絲裂霉素C養液(用DMEM+15%NBS配制)，將培養皿置于37°C，5%CO2，飽和濕度的培養箱中培養2～4h；移去絲裂霉素C液，用PBS洗滌培養細胞4～5次，加入4ml0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化1～2分鐘，用1ml加樣器吹打細胞，使細胞離散，再加入等體積培養液終止消化，制成細胞懸液；將細胞懸液置于離心管1000轉/分鐘離心4～5分鐘，棄去上清液，加入培養液，將細胞濃度調至2～4×105個/ml；在4孔板的每個孔中加入0.6ml細胞懸液，置于CO2培養箱中培養24h；該培養體系用于培養胚胎之前，需更換新鮮培養液。胚胎處理和胚胎培養條件

①采用超數排卵的方法處理動物,選取發情靜止期(外陰呈白色)小鼠于晚二十點時腹腔注射PMSG(10IU/只)，48h后腹腔注射HCG(10IU/只)，按1∶1公母比例合籠，次日上午八點以前檢查，若母鼠有陰道栓，確認其交配受精，在見栓后84～96h內，用常規方法從子宮沖取胚胎。

②培養液:為DMEM(低糖)+15mL/LNBS+0.1mmol/Lβ-巰基乙醇+0.1μmol/LNa2SeO3+1000IU/mLLIF+10ng/mL胰島素生長因子。③胚胎的培養將小鼠胚胎置于胎兒成纖維細胞飼養層上進行培養。培養條件為37℃、5mL/100mLCO2、飽和濕度。牛胚胎培養條件為38℃、5mL/100mLCO2、飽和濕度。若干天后，出現鳥巢狀的內細胞團集落。(3)ICM獲取:ICM初次傳代體外培養ICM細胞6～7天，細胞數量增殖到一定程度后，選擇生長集中、隆起明顯、呈鳥巢狀，形態上仍保持未分化的ICM集落進行傳代。具體程序是，用玻璃針剝離ICM表面覆蓋的滋養層細胞，再將ICM挑出。用無鈣鎂離子PBS洗滌一次，置于0.25g/100mL胰蛋白酶+0.04g/100mLEDTA消化液中，在37℃條件下處理3～5min，再轉入含血清(15mL/100mL)的培養液中，用毛細管玻璃針撥離，吹打，制備細胞團懸液(每個細胞團含3～10個ICM細胞)。將ICM細胞團懸液接種于鋪有新制備飼養層(提前12～24小時制備)的4孔板中。在38℃，飽和濕度和5%CO2的條件下培養，每2-3天更換1次培養液。(5)ES細胞繼代克隆培養3-5天后，當飼養層表面出現類ES集落時，棄去培養液，加入無鈣鎂PBS沖洗2～3次。用玻璃針撥離隆起明顯、細胞排裂緊密的ES樣細胞集落，使其脫離PMEF飼養層。用吸管將集落轉移至消化液中，37℃處理。再將集落移入培養液中，用毛細管玻璃針撥離集落，制成ES細胞塊懸液。將ES細胞接種于新鮮飼養層表面，加入培養液，以后每3～5天傳代1次。4.動物胚胎干細胞的應用（1）生產克隆動物為克隆動物生產提供供體細胞（2）為醫學提供醫用材料利用胚胎干細胞，定向誘導分化形成組織，可為器官移植提供材料（3）生產轉基因動物：培養胚胎干細胞，并用外源基因轉染胚胎干細胞，經過篩選，可獲取轉基因細胞，以此為材料，克隆動物，可獲取轉基因動物。改良動物，制備生物反應器。（4）建立藥物評價模型：細胞（5）研究細胞分化、組織形成的基本規律（6）研究基因的功能：缺失，突變（7）制備動物模型5.動物胚胎干細胞的鑒定（1）形態：形成胚胎干細胞的典型形態—“鳥巢狀”細胞團；（2）生長特性：能無限克隆性生長；（3）標記物：表達胚胎干細胞的多種標記物，如磷酸堿性酶、端粒酶活性高等；（4）分化特性，包括體內、體外分化，具有全能性（5）遺傳學特性：核型分析6.胚胎干細胞的誘導分化與發育（1）神經細胞（2）造血細胞（3）肌細胞（4）血管和內皮細胞（5）胰島細胞。

（6）骨細胞

7.胚胎干細胞研究面臨的困難（1）胚胎干細胞體外擴增易發生分化胚胎干細胞無論在體內、外均具有自我分化潛能，極易分化為其它細胞。目前研究添加白血病抑制因子可抑制分化。（2）定向誘導胚胎干細胞分化為功能性器官目前條件、機制不清最近的研究表明，只要將干細胞注射到患病部位，干細胞能自我分化，發揮修復作用。但器官的形成復雜，利用干細胞人造器官任重而道遠；（3）胚胎干細胞的安全性問題（4）涉及倫理、社會、道德的爭議胚胎的發育歷程牛胚胎干細胞源于原始生殖細胞的胚胎干細胞源于胚胎內細胞團的胚胎干細胞1.牛桑椹胚2。牛孵化胚3。牛內細胞團4。小鼠胚胎干細胞集落1。猴胚胎干細胞2。牛胚胎干細胞3。小鼠胚胎干細胞胰腺干細胞集落源于胚胎干細胞的神經樣細胞源于胚胎干細胞的網狀組織源于胚胎干細胞的成骨細胞四、轉基因動物的生產（theproductionoftransgenicanimal）（一）有關轉基因動物生產的概念

conceptoftransgenicanimalproduction1.轉基因（transgenic）：把分離獲得的目的基因導入導受體細胞或受精卵中去的過程。2.受體細胞（receptorcell）：接受目的基因的細胞。3.目的基因（targeticgene）：目的基因也稱為目標基因，是指具有特定功能，需要導入到動物基因組或需要進行遺傳操作的基因。4.基因組（genegroup）：是指動物個體或群體所包含的所有類型基因的總和。5.轉染（transfection）：將目的基因插入受體細胞的基因組的特定部位的過程。6.轉化（transformation）：目的基因連接于染色體基因組，并進行表達的現象。7.載體（vector）：攜帶目的基因的DNA片段。8.轉基因動物（transgenicanimal）：是指對動物基因組進行遺傳操作（導入目的基因或改變原有基因結構），并使這種改變的遺傳信息能夠在后代穩定遺傳的動物，稱為轉基因動物。9.動物生物反應器（biologyreactorbyanimalproduction）：能夠從血液、乳汁或其它產品中提取和生產具有很高價值的蛋白質的轉基因動物。（二）轉基因動物生產的程序（theprotocalforproductionoftransgenicanimal）1.分離和克隆目的基因（1）人工合成DNA片段：以已知DNA片段為模板合成DNA。（2）人工合成cDNA

提取mRNA，利用反轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA。（3）由蛋白質推測DNA結構，合成目的DNA片段。外源基因在細胞內的表達：將轉基因細胞移植到去核卵母細胞，使其表達外源基因利用胚胎細胞嵌合法生產轉基因動物示意圖利用胚胎干細胞進行核移植生產轉基因動物示意圖2.重組DNA（1）將目的基因用連接酶與載體連接。（2）載體連接有標記基因和調控基因。（3）標記基因對某種藥物具有抗藥性（抗土霉素基因、抗新霉素基因），在含有抗生素培養基中生存的細胞為轉基因細胞（攜帶外源基因），死亡的細胞為非轉染外源基因的細胞。（4）調控基因包含有啟動子、轉錄子、增強子和操縱子。（5）重組DNA包含有結構基因、調控基因和標記基因。載體能將目的基因、調控基因和標記基因插入基因組的特定位置。3.克隆重組DNA在體外，利用PCR技術擴增重組DNA，當重組DNA濃度達到一定數量時，用于轉染細胞。4.將外源基因導入動物基因組的途徑（1）顯微注射法利用顯微操作儀將重組DNA注射到受精卵原核（雌性原核或雄性原核），卵裂球DNA在復制過程中，將重組DNA整合到胚胎DNA中。這種導入重組DNA的方法操作繁瑣，基因整合隨機性強，轉基因效率低。（2）精子載體法先將重組DNA用一定方法處理，再將重組DNA與精子共同孵育，使重組DNA進入精子內，利用受精過程將重組DNA導入到受精卵。優點是操作簡單，缺點是整合效率低。（3）反轉錄病毒感染法將外源基因插入到反轉錄病毒RNA特定部位，利用病毒感染細胞，將重組DNA攜帶入受體細胞，并進一步整合至細胞基因組。優點是操作簡單，整合效率高，單位點、單拷貝整合。缺點是攜帶外源基因長度不能超過15kb。（4）SV40載體（Vectorofsimianvacuolatingvirus40，SV40，猿猴空泡病毒載體）。（5）乳頭狀瘤病毒載體法（papilloma）（6）腺病毒載體法（adenovirus）（7）胚胎干細胞介導法（introductionoftargetgenebyEScell）將重組DNA導入胚胎干細胞，利用胚胎干細胞核移植或胚胎嵌合的方法生產轉基因動物。（8）體細胞介導法（introductionoftargetgenebysomaticcell）將重組DNA導入體細胞，利用體細胞核移植的方法生產轉基因動物。5.將外源基因導入細胞的方法（1）磷酸鈣沉淀法將外源基因與CaCl混合，再加入Hepers-磷酸鹽緩沖液，制備DNA-磷酸鹽沉淀物，將沉淀物移至單層細胞表面，進行培養，使外源基因轉移至動物細胞內。（2）DEAE-葡聚糖轉基因技術將二乙胺基葡聚糖（diethylaminoethyl-dextran，DEAE-dextran）與重組DNA混合，加入細胞表面，外源基因就會進入動物細胞內。（3）電脈沖法將DNA與經秋水仙素處理的細胞混合，用高壓脈沖電流刺激細胞，使細胞膜瞬間打開，使重組DNA進入受體細胞。（4）脂質體載體介導法；利用脂質體包埋重組DNA，將其與經PGE處理的細胞共同培養。6.轉基因細胞體外培養（cultureoftransgeniccellinvitro）7.轉基因細胞的篩選將細胞在特定培養基中培養，能存活的即為攜帶外源基因的細胞。對轉染外源基因的細胞進行篩選篩選轉染外源基因細胞的程序8.外源基因整合、轉錄和表達的檢測（1）Southern雜交制備目的DNA探針（以目的DNA為模板，以經過標記的堿基為原料，利用PCR技術，擴增生產目的DNA探針），從細胞中提取并純化DNA，擴增DNA，酶切DNA，變性、電泳、轉移目的DNA片段，用目的DNA探針進行雜交，陽性者為目的DNA已整合到基因組中。（2）Northern雜交目的DNA探針與受體細胞mRNA雜交，呈陽性者，為外源基因已經轉錄。（3）Western雜交標記蛋白質與受體細胞蛋白質雜交，呈陽性者，為外源基因已經翻譯。（4）免疫法9.轉基因胚胎的生產（1）轉基因細胞核移植法（2）胚胎嵌合法10.誘導發情與胚胎移植11.受體動物妊娠、分娩產生轉基因動物12.轉基因動物品系或品種的建立選種、選配，固定目的基因，使其穩定遺傳

（三）轉基因動物生產研究的意義