實驗八

親和層析分離純化目標蛋白實驗目的掌握GST親和層析分離純化目標蛋白的原理和實驗方法（第一部分）掌握SDS檢測目標蛋白原理和方法（第二部分）第一部分

GST親和層析分離純化目標蛋白親和層析原理

生物大分子與配體特異非共價可逆結(jié)合酶-底物酶-底物類似物（酶的競爭性抑制劑）抗體-抗原激素-受體外源凝集素-多糖、糖蛋白、細胞表面受體核酸-互補核苷酸序列（Oligo-dT）親和層析原理GST親合層析谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST，26kd）谷胱甘肽（GSH）作為配體，共價結(jié)合在葡聚糖上，（Sepharose4B）葡聚糖上的GSH與GST結(jié)合用還原型GSH洗脫GSTGSH-Sepharose4BGSH-Sepharose4BGSH-Sepharose4B實驗步驟一、細胞破碎3600mL誘導后的菌液，離心分裝到12只50mL離心管，-20℃保存。（每個班用2管）每管加30mLPBS緩沖液，混勻；超聲3S，暫停5S，持續(xù)15min；平衡，10000rpm/，5min，離心；取25uL上清，作為分離純化前的樣品；每組分取3-5mL上清液，上柱純化。二、裝GSH-Sepharose4B柱1.清洗和裝好層析柱，封閉出口；2.加入2mLPBS；3.取1-2mlGSH-Sepharose4B，加入柱子中；4.打開柱子出口，使PBS緩慢流出。注意：始終保持柱內(nèi)的液面高于GSH-Sepharose4B

三、純化目的蛋白1.用5mlPBS緩沖液洗柱床，重復3遍。2.將混合蛋白質(zhì)溶液2-3mL加到柱子中。3.用5mlPBS緩沖液洗柱子，重復3遍。4.加入1.5ml洗脫液。5.用1.5mL離心管收集洗脫液，每管收集0.3ml（約6滴）,共收集5管。6.PBS緩沖液洗柱子3遍，關(guān)閉出口。7.將第3、4管和第5管用于目的蛋白的檢測。四、SDS樣品制備

0號樣：過柱前的蛋白溶液40uL，加10uL5X

上樣緩沖液。

3號樣：洗脫的蛋白溶液（3號管）40uL，加10uL5X上樣緩沖液。

4號樣：洗脫的蛋白溶液（4號管）40uL，加10uL5X上樣緩沖液。5號樣：洗脫的蛋白溶液（5號管）40uL，加10uL5X上樣緩沖液。

混勻后在沸水中加熱3-5min。03450345M每個樣點30微升親和層析試劑PBS（pH7.4）NaCl（58.5）40g；KCl（74.5）1.0g；KH2PO4（136.09）1.2g；Na2HPO4·12H2O（358.14）18.1g；加水定容到5000mL。親和層析試劑50mMTris-HCl（pH8.0）Tris（121.14）6.055g，溶于900mL水，用HCl調(diào)pH到8.0，用水定容至1000mL。洗脫液還原型谷胱甘肽（307.32）0.15366g，溶于50ml50mMTris-HCl（pH8.0）中。第二部分

SDS檢測目標蛋白實驗目的掌握SDS檢測蛋白原理和方法掌握垂直板電泳的操作方法實驗步驟1、洗凈玻璃板，蒸餾水沖洗3遍，吹干并安裝電泳槽。2、制作12%分離膠。按下表中所列順序加試劑，輕輕搖勻，加入兩塊玻璃板間，高度約玻璃板高度的一半。3、用1mL蒸餾水封住分離膠液面，室溫聚合約30min，至分離膠與水之間出現(xiàn)一條清亮的分界線，倒掉水層，用濾紙條吸干殘余的水。4、倒出水并用濾紙吸干，配好5%濃縮膠，輕輕搖勻，加入濃縮膠，迅速插入樣梳，靜置約30分鐘。

※水封的目的是為了使分離膠上沿平直，并排除氣泡。

※凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。※樣梳需一次平穩(wěn)插入。梳口處不得有氣泡，梳底需水平。12%分離膠試劑名稱12%分離膠ddH2O2.5mL30%Acr-Bis(29:1)3.0mL1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0mL10%SDS75uLTEMED（加速劑）10uL10%APS（催化劑，最后加）75uL總體積7.5mL分離膠的高度為整個凝膠高度的一半試劑名稱5%ddH2O3.4mL30%Acr-Bis

（29:1）0.86mL1MTris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50uLTEMED20uL10%AP（最后加）50uL總體積5mL5%濃縮膠5.將膠板放入電泳槽，加入1×Tris-Gly電泳緩沖液，拔掉梳子，液面應該完全沒過電極。6.點樣（Marker和待測蛋白樣，加入樣品緩沖液）每個點樣孔點30uL樣品，每板膠點15uLMarker。

加樣前，樣品在沸水中加熱3分鐘，以除掉亞穩(wěn)態(tài)聚合7.80V電泳約30min，等蛋白進入分離膠后，將電壓調(diào)節(jié)到120V，繼續(xù)電泳。溴酚藍接近膠底部時，關(guān)閉電源。電泳結(jié)束。實驗步驟8、撬開玻璃板，將凝膠做好標記，切除多余的膠，放在塑料盒內(nèi)，加入染色液，染色30min左右。(染色液需回收，可反復使用)9、染色后的凝膠用蒸餾水煮沸脫色。（高火微波爐中煮5分鐘）10、觀察實驗步驟純化前純化后mark實驗試劑

低分子量標準蛋白

兔磷酸化酶B97400

牛血清白蛋白66200

兔肌動蛋白43000

牛碳酸酐酶31000

胰蛋白酶抑制劑20100

雞蛋清溶菌酶14400實驗結(jié)果分析繪制標準曲線：logMW=K-bm

蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至分離膠上沿距離相對遷移率=

溴酚藍至分離膠上沿距離

以每個蛋白標準的分子量對數(shù)作縱坐標，相對遷移率作橫坐標，作標準曲線，然后在計算出待測蛋白的遷移率即可在標準曲線上查出其分子量。蛋白質(zhì)與SDS按1：1.4比例形成復合物，消除了各種蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)的遷移速度只取決于分子大小。在15-200KD之間，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系：logMW=K-bm實驗原理不連續(xù)系統(tǒng):

緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性。

電荷效應、分子篩效應、濃縮效應。連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同。電荷、分子篩效應。（三個不連續(xù)性）1、凝膠孔徑的不連續(xù)性（2種孔徑的凝膠）2、緩沖液離子成分及pH值的不連續(xù)性（2種緩沖體系，3種pH）：濃縮膠，pH6.8，蛋白質(zhì)分子的遷移率比Cl-

低，比Gly高。3、電位梯度不連續(xù)性：快離子（Cl-

）后面形成高電位梯度區(qū)，慢離子（Gly）前面形成低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電位梯度之間的地方，形成一個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的界面，蛋白質(zhì)分子在界面處濃縮成一個狹小的中間層。濃縮效應SDS試劑1.30%（W/V）凝膠：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）1.0g，加水到100mL。2.分離膠緩沖液（pH8.8，1.0mol/LTris-HCl）：三羥甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，加約80mL蒸餾水，用1.0mol/LHCl調(diào)節(jié)pH到8.8，用蒸餾水稀釋到100mL。3.濃縮膠緩沖液（1.0mol/LTris-HCl，pH6.8）

Tris12.1g，加約60mL蒸餾水，用1.0mol/LHCl調(diào)節(jié)pH到6.8，加蒸餾水到100mL。4.10.0%（W/V）SDS5.10.0%（W/V）過硫酸銨（現(xiàn)用現(xiàn)配）6.10X電極緩沖液（pH8.3）：Tris30.3g，Gly144.2g，SDS10.0g，加水到1000mL。（用時稀釋10倍）7.蛋白質(zhì)標準溶液：低分子量蛋白質(zhì)標準，加200uL水溶解，加50uL上樣緩沖液。8.上樣緩沖