ICS65.020.01DB12B16天津市地方標(biāo)準(zhǔn)DB12/T1006—2020茄子黃萎病菌土壤帶菌PCR檢測技術(shù)規(guī)程TechnicalregulationofPCRdetectionforverticilliumdahliaeinsoil天津市市場監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布DB12/T1006—2020前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：高葦、王勇、楊利娟、賁海燕、張春祥、劉曉琳、姚玉榮、王萬立。IDB12/T1006—2020茄子黃萎病菌土壤帶菌PCR檢測技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了茄子黃萎病菌的PCR檢測的儀器和試劑、土壤取樣、PCR檢測、結(jié)果判定、土樣及資料保存。本標(biāo)準(zhǔn)適用于土壤中茄子黃萎病菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡注日期的應(yīng)用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂版）均適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T36197-2018土壤質(zhì)量土壤采樣技術(shù)指南GB/T36199-2018土壤質(zhì)量土壤采樣程序設(shè)計(jì)指南3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。茄子黃萎病菌大麗輪枝菌（VerticilliumdahliaKleb.）可以侵染多種植物引起一種土傳的維管束病害，病菌可在土壤中長期存活，是茄果類作物生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的土傳病害。茄子黃萎病菌的基微菌核verticilliumwiltofeggplant茄子黃萎病菌生長過程中，一條或多條菌絲體膨大、細(xì)胞壁增厚后，多向芽殖而形成的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，土壤中攜帶能夠誘發(fā)侵染植株發(fā)病的病原菌。4渦旋振蕩儀、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機(jī)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（PCR儀）、水浴鍋、電子天平（感量0.1g和0.1mg）、電泳儀、凝膠成像儀。1DB12/T1006—2020水飽和酚、三氯甲烷、液氮、異丙醇、無水乙醇、DNA熒光染料（GelRed）、Tris-HCl等。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker，能夠區(qū)分100bp～1000bp的DNA片段）。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）抽提液：2%CTAB，100mmol/LTris·Cl（pH8.0），20mmol/LEDTA（pH8.0），1.4mol/L氯化鈉。PCR反應(yīng)混合物：2×MasterMix:TaqDNA聚合酶，2×PCR反應(yīng)緩沖液，dNTP混合物等。10×TAE電泳緩沖液：242gTris-base，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）加蒸餾水至1000mL，使用時(shí)稀釋10倍。除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682要求。5待測土壤取樣土壤采樣按照GB/T36199-2018和GB/T36197-2018的有關(guān)要求進(jìn)行，每塊栽培地（面積667m2左右）按照“S”采樣法設(shè)置15個(gè)采樣點(diǎn)，使用不銹鋼土壤取樣器采集0～40cm耕層土樣，將所有采樣點(diǎn)土壤混勻后放入采樣袋中。6檢測與鑒定6.1土壤樣品預(yù)處理將采集的土壤樣品送回實(shí)驗(yàn)室后，打開采樣袋在室內(nèi)自然風(fēng)干（自然風(fēng)干時(shí)間不能超過24h），然后采用2mm孔徑的土壤篩過濾土壤，過濾后的土樣進(jìn)行檢測。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)3個(gè)平行，每個(gè)重復(fù)稱取1g土樣，放入滅菌的研缽中，加入液氮充分研磨。向研缽中加入4mL預(yù)熱的CTAB抽提液，倒入15mL滅菌離心管中，反復(fù)震蕩混合后，65℃水浴30min，4℃14000g離心10min，保留上清液。取上清液，加入等體積水飽和酚，充分混勻后，4℃14000g離心10min。取上清液，加入等體積的三氯甲烷:異戊醇（24:1），4℃14000g離心10min。繼續(xù)三氯甲烷:異戊醇（24:1）抽提，直至有機(jī)相和水相之間無蛋白層為止。吸取上清，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇混勻，4℃14000g離心10min，可見DNA沉淀。棄去上清液，70％冷乙醇，漂洗DNA沉淀2次～3次，充分風(fēng)干后溶解于適量去離子水中。將得到的土壤DNA樣品進(jìn)行10倍、100倍和1000倍梯度稀釋，取DNA原液和稀釋后的各梯度DNA溶液各1μL，加入到PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照（陰性對(duì)照為不含茄子黃萎病菌1g土壤提取的DNA，陽性對(duì)照為含茄子黃萎病菌1g土壤提取的DNA），空白對(duì)照為未加入DNA模板。具體PCR檢測方法見附錄B。7陽性對(duì)照經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后出現(xiàn)334bp大小的條帶，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照不出現(xiàn)任何條帶，試2DB12/T1006—20207.2在試驗(yàn)結(jié)果成立的前提下，土壤樣品DNA擴(kuò)增出與陽性對(duì)照一致的334bp條帶，則說明土壤中存在茄子黃萎病菌，否則則說明不存在黃萎病菌。8土樣及資料保存檢測判定完成后，土壤樣品保存方法按照GB/T36197-2018有關(guān)要求執(zhí)行。檢測判定過程及有關(guān)數(shù)據(jù)、表格要進(jìn)行詳細(xì)記錄并歸檔保存。3DB12/T1006—2020AA附錄A（資料性附錄）茄子黃萎病菌的分類地位、病原特征及發(fā)病癥狀A(yù).1病原及其分類地位茄子黃萎病由大麗輪枝菌（VerticilliumdahliaeKleb.）引起，屬于半知菌亞門（Deutermycotina），從梗菌科（Moniliaceae），輪枝菌屬（Verticillium）。已報(bào)道的茄子黃萎病的病原菌為黑白輪枝菌（V.albo-atrum）和大麗輪枝菌（V.dahliae）。而我國國內(nèi)對(duì)于茄子黃萎病的病原鑒定結(jié)果均為大麗輪枝菌（V.dahliae）。A.2病原特征茄子黃萎病病原大麗輪枝菌（V.dahliae），寄主范圍廣泛，可以危害茄子、棉花、草莓、馬鈴薯、辣椒等多200多種農(nóng)作物，其形成的微菌核在無寄主的土壤中可存活10年以上，是主要的初侵染源。A.3癥狀及危害茄子黃萎病在茄子整個(gè)生長期均有發(fā)生，在門茄坐果時(shí)表現(xiàn)出癥狀，盛果期最為嚴(yán)重。茄子黃萎病發(fā)病時(shí)，下部葉片葉脈間或葉緣產(chǎn)生淡黃色斑點(diǎn)，逐漸發(fā)展到半邊葉片或整個(gè)葉片變黃，發(fā)病嚴(yán)重導(dǎo)致病葉大量脫落。茄子黃萎病多數(shù)從一邊開始發(fā)病，另外半邊正常，俗稱“半邊瘋”。解剖病株可發(fā)現(xiàn)根、莖、分枝以及葉柄等部位維管束變成褐色。茄子黃萎病田間癥狀如圖A.1所示。圖A.14DB12/T1006—2020BB附錄B（規(guī)范性附錄）茄子黃萎病病原PCR檢測方法B.1茄子黃萎病病原特異性引物Vd-ITS1-45-F：5’-CCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’Vd-ITS2-379-R：5’-ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’引物序列：Vd-ITS1-45-F：5’-CCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’Vd-ITS2-379-R：5’-ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’該特異引物擴(kuò)增序列信息：上游引物Vd-ITS1-45-Fccggtccatcagtctctctgtttataccaacgatacttctgagtgttcttagcgaactat161taaaacttttaacaacggatctcttggctctagcatcgatgaagaacgcagcgaaacgcg121atatgtagtgtgaattgcagaattcaggaatcatcgaatctttgaacgcacatggcgcct181tccagtatcctgggaggcatgcctgtccgagcgtcgtttcaaccctcgagccccagtggc241ccggtgttggggatctacgtctgtaggcccttaaaagcagtggcggacccgcgtggccct301tcctatgcgtagtagttacagctcgcatcggagt下游引物Vd-ITS1-379-R按下列組分制備PCR反應(yīng)體系50μL，反應(yīng)同時(shí)陰性對(duì)照和空白對(duì)照，具體反應(yīng)體系見表B.1。將下列B.1PCR反應(yīng)體系中各組分加入PCR反應(yīng)管中，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。表B.1PCR反應(yīng)體系EeraldAmpMaxPCRMasterMix（2×MasterMix）（CodeRR320）配置20g/L質(zhì)量濃度的瓊脂糖凝膠。每100mL的瓊脂糖凝膠溶液中加入5μLEB或其他核酸