液相色譜技術色譜分離分析技術基于組分在兩相間分配系數差異課程目標和大綱掌握原理色譜分離機制了解儀器HPLC系統構成方法開發條件優化技巧應用案例液相色譜的歷史發展11903年茨維特發明色譜法21940年代分配色譜理論建立31960年代高效液相色譜出現41990年至今色譜分離的基本原理固定相色譜柱填料移動相液體溶劑系統分配作用組分在兩相間分配分離效果不同保留時間分配系數和保留因子分配系數K固定相/移動相中濃度比保留因子k'衡量組分在柱中停留程度選擇性因子α兩組分保留因子比值液相色譜的類型正相色譜極性固定相1反相色譜非極性固定相2離子交換基于電荷交換3尺寸排阻基于分子大小4親和色譜特異性結合5正相色譜和反相色譜的比較特點正相色譜反相色譜固定相極性非極性移動相非極性極性洗脫順序非極性先出極性先出應用范圍較窄廣泛高效液相色譜（HPLC）簡介1高壓系統數百至上千PSI工作壓力2微粒填料3-10μm粒徑填料3高效分離復雜樣品快速分離4自動化程度高全程計算機控制HPLC與傳統液相色譜的區別傳統液相色譜低壓、大顆粒、慢高效液相色譜高壓、微粒、快速自動化程度全自動進樣和數據處理HPLC儀器組成概覽溶劑輸送系統高壓泵進樣系統手動/自動進樣器色譜柱分離單元檢測器信號采集數據系統控制和分析溶劑輸送系統恒流泵維持穩定流速溶劑脫氣防止氣泡影響梯度系統混合多種溶劑壓力監測安全保護功能高壓泵的類型和工作原理往復式泵單柱塞/雙柱塞柱塞泵容積式輸液隔膜泵防腐蝕設計蠕動泵低壓應用進樣系統設計1六通閥樣品定量導入系統2定量環確保進樣體積準確3針頭清洗避免交叉污染4壓力承受能力耐受系統高壓自動進樣器的優勢精確度注射精度高達±0.1%高通量連續分析數十上百樣品自動化無需人工干預，節省人力色譜柱概述分析柱常規分析使用制備柱大量分離純化保護柱延長主柱壽命固定相的種類和特點C18最常用反相填料1C8中等疏水性2氨基正相/弱陰離子交換3硅膠極性相互作用4苯基π-π相互作用5色譜柱的選擇標準1樣品特性極性、分子大小2目標要求分析速度vs分辨率3柱效率理論塔板數4兼容性與流動相、檢測器匹配柱溫控制的重要性提高重現性減少保留時間變化改善峰形減少峰展寬加快分析降低溶劑黏度特殊分離溫度梯度分離檢測器類型概覽檢測器選擇取決于分析物特性和檢測需求紫外-可見光檢測器原理分析物吸收特定波長光類型固定波長、可變波長、二極管陣列優勢通用性強、靈敏度高限制需含發色團熒光檢測器激發特定波長光照射1發射檢測發射熒光2高靈敏度比UV檢測靈敏10-1000倍3高選擇性專一性識別4示差折光檢測器1原理測量樣品與參比折光率差異2特點通用性檢測器3優勢幾乎檢測所有組分4局限性溫度敏感、靈敏度低電化學檢測器安培型測量氧化/還原電流庫侖型測量總電量電導型測量溶液電導率應用范圍神經遞質、藥物代謝物質譜檢測器簡介離子化將分子轉化為帶電離子質量分析按質荷比分離離子檢測檢測不同離子的豐度數據處理生成質譜圖數據處理系統儀器控制方法設置與執行數據采集色譜圖記錄數據分析峰識別與積分報告生成結果展示與存檔流動相的作用和選擇溶解樣品確保樣品完全溶解兼容固定相不破壞色譜柱調節選擇性影響分離效果檢測兼容性低背景信號有機溶劑在HPLC中的應用溶劑極性指數UV截止波長應用甲醇5.1205nm通用乙腈5.8190nm低UV四氫呋喃4.0212nm特殊異丙醇3.9205nm高黏緩沖液的使用和注意事項1pH控制影響化合物離子化狀態2濃度選擇通常10-50mM3溶解度考慮避免鹽析出4兼容性不可使用磷酸鹽于LC-MS梯度洗脫技術起始條件高極性溶劑比例梯度變化非極性溶劑逐漸增加目標條件洗脫強溶劑比例平衡再生回到起始條件等度洗脫vs梯度洗脫等度洗脫溶劑組成恒定簡單樣品重現性好梯度洗脫溶劑組成變化復雜樣品峰形改善樣品制備技術過濾去除不溶物1提取從基質中分離2濃縮提高檢測靈敏度3衍生化改善檢測特性4固相萃取（SPE）原理活化潤濕吸附劑上樣樣品通過固相清洗去除干擾物洗脫目標物洗脫回收液液萃取技術1原理基于溶解度差異分配2常用溶劑乙酸乙酯、正己烷、氯仿3pH調節控制分配系數4鹽析提高萃取效率樣品前處理的重要性1提高分析結果可靠性準確定量2保護色譜系統延長柱壽命3提高樣品質量濃縮目標物4去除基質干擾避免背景干擾方法開發策略樣品特性分析了解物理化學性質色譜模式選擇正相/反相/離子交換初步條件篩選柱、溶劑系統初選條件優化精細調整分離參數方法驗證評估方法可靠性色譜條件優化1流動相組成溶劑比例、pH值2色譜柱選擇填料類型、尺寸3流速調整平衡效率與壓力4溫度控制提高選擇性分離度和選擇性的調整分離度Rs衡量兩峰分離程度影響因素選擇性α、柱效率N、保留因子k'改善方法調整pH、改變溶劑極性峰形優化技巧拖尾問題加入離子對試劑或調整pH峰展寬減小進樣量或增加效率峰重疊調整選擇性或增加理論塔板數鬼峰系統清洗和空白檢測系統適用性測試分離度Rs≥1.5理論塔板數N>2000拖尾因子T≈0.8-1.5相對標準偏差RSD≤2%定量分析方法峰面積法與濃度成正比峰高法窄峰高靈敏度內標法消除系統誤差外標法直接與標準比較外標法和內標法外標法直接比較標樣簡單直觀適用穩定系統內標法加入內標物質高精度消除系統波動標準曲線的建立濃度(μg/mL)峰面積標準曲線應覆蓋分析濃度范圍，線性關系良好方法驗證要素123456特異性能區分目標物線性范圍響應與濃度關系精密度重復性評價準確度回收率測定穩定性耐用性評價檢測限最低可檢水平線性范圍和檢出限線性范圍檢測器響應與濃度成比例區間檢出限(LOD)最低可檢測濃度，S/N>3定量限(LOQ)最低可定量濃度，S/N>10精密度和準確度評估重復性同條件短時間內重復測定中間精密度不同天、不同操作者重現性不同實驗室間回收率加標回收實驗液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）系統整合色譜分離+質譜鑒定接口技術ESI、APCI應用范圍復雜樣品定性定量離子源類型及其應用離子源原理適用范圍電噴霧(ESI)電場霧化極性分子、生物大分子大氣壓化學電離(APCI)電暈放電中低極性小分子大氣壓光電離(APPI)光電離低極性化合物基質輔助激光解吸電離(MALDI)激光能量轉移大分子質量分析器簡介1四極桿低成本、快速掃描2離子阱高靈敏度、MSn能力3飛行時間高分辨率、無質量限制4磁場扇形高分辨率、精確質量LC-MS/MS技術及應用一級質譜分子量信息離子選擇母離子篩選碰撞誘導裂解產生碎片離子二級質譜結構確證手性分離技術手性固定相環糊精、大環抗生素、多糖手性添加劑移動相添加手性選擇劑重要性藥物對映體活性差異巨大離子交換色譜陽離子交換分離正電荷物質1陰離子交換分離負電荷物質2pH控制影響離子化狀態3應用氨基酸、蛋白質、核酸4親和色譜原理及應用特異性相互作用類似鎖與鑰匙溫和條件保持生物活性高選擇性特異性分離生物分子純化抗體、酶、核酸凝膠滲透色譜原理基于分子大小分離過程大分子先洗脫應用分子量分布測定超高效液相色譜（UHPLC）小粒徑填料<2μm顆粒超高壓系統可達1000bar優勢更快速、更高效、更節省液相色譜在藥物分析中的應用藥物開發全周期分析支撐技術環境分析中的液相色譜技術1水質監測農藥、抗生素殘留2空氣污染物多環芳烴、酚類化合物3土壤分析持久性有機污染物4樣品前處理SPE、濃縮富集食品安全檢測應用實例霉菌毒素黃曲霉毒素、嘔吐毒素農藥殘留有機磷、擬除蟲菊酯食品添加劑防腐劑、甜味劑生物大分子分析的特殊考慮蛋白質穩定性避免變性條件親水