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色譜分離技術(shù)根據(jù)分離時(shí)一次進(jìn)樣量得多少,色譜分離得規(guī)模可分為色譜分析規(guī)模(小于10mg)、半制備(10~50mg)、制備規(guī)模(0、1~10g)和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模(>10g)。色譜分離得規(guī)模小,但產(chǎn)值高。三、色譜分離技術(shù)得分類超臨界流體色譜—流動(dòng)相就是在接近她得臨界溫度和壓力下工作得液體三、色譜法得分類根據(jù)流動(dòng)相得相態(tài)不同:氣相色譜—以氣體作流動(dòng)相液相色譜—以液體作流動(dòng)相—固定相涂敷在玻璃或金屬板上—薄層色譜三、色譜法得分類根據(jù)固定相得附著方式分類

—液體固定相涂在紙上—紙色譜(平板色譜)—固定相裝在圓柱管中—柱色譜三、色譜法得分類吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法親和色譜法按分離機(jī)理不同,可分為:三、色譜法得分類根據(jù)操作壓力得不同分類:低壓色譜:操作壓力<0、5MPa中壓色譜:操作壓力0、5~4、0MPa高壓色譜:操作壓力4、0~40MPa三、色譜法得分類根據(jù)操作方法不同,色譜法可分為:前沿分析法(迎頭法)置換展開(kāi)法(頂替法)洗脫展開(kāi)法(洗脫分析法)色譜法得缺點(diǎn)就是處理量小、操作周期長(zhǎng)、不能連續(xù)操作。四、色譜法得特點(diǎn)(1)分離效果高(2)應(yīng)用范圍廣(3)選擇性強(qiáng)(4)設(shè)備簡(jiǎn)單大家有疑問(wèn)的,可以詢問(wèn)和交流可以互相討論下,但要小聲點(diǎn)吸附色譜法吸附色譜法(adsorptionchromatography,AC)就是靠溶質(zhì)與吸附劑之間得分子吸附力得差異而分離得方法。吸附色譜得固定相為固體吸附劑,如有較強(qiáng)極性硅膠、中等極性氧化鋁、非極性炭及特殊作用得分子篩等。吸附色譜就是靠溶質(zhì)與吸附劑之間得分子吸附力得差異而分離得方法。吸附力主要就是范德華力,有時(shí)也可能形成氫鍵或化學(xué)鍵。吸附法得關(guān)鍵就是選擇吸附劑和展開(kāi)劑。1、基本原理吸附色譜分離過(guò)程示意圖

下列三個(gè)化合物用硅膠吸附色譜分離,以石油醚-乙酸乙酯(95:5)洗脫,判斷三者流出色譜柱先后順序。

ABC由先到后:C→B→A

舉例:平衡系數(shù)(分配系數(shù)、吸附系數(shù)、選擇性系數(shù))K=cs/cm

cs—固定相中得濃度;cm—流動(dòng)相中得濃度影響K得因素:被分離物質(zhì)本身得性質(zhì)、固定相和流動(dòng)相得性質(zhì)、色譜柱得操作溫度。K差異越大,色譜分離效果越理想。阻滯因數(shù)(比移值)斑點(diǎn)到原點(diǎn)得距離Rf值=————————溶劑前沿到原點(diǎn)距離阻滯因數(shù)①0≤Rf≤1Rf越大,溶質(zhì)隨流動(dòng)相移動(dòng)快,被洗脫速率也就越快。②當(dāng)Rf=1,此種溶質(zhì)不溶于固定相,隨流動(dòng)相以同樣得速率移動(dòng)。③當(dāng)Rf=0,此種溶質(zhì)不溶于流動(dòng)相,而被吸附在固定相上。選用吸附色譜法分離化合物時(shí),必須首先了解被分離化合物得性質(zhì),然后選擇合適得吸附劑和展開(kāi)劑。被分離化合物、吸附劑和展開(kāi)劑三者關(guān)系配合恰當(dāng)才能得到較好得分離效果。2、吸附劑與展開(kāi)劑薄層色譜法選擇得主要吸附劑為氧化鋁、硅膠和聚酰胺。色譜用得吸附劑要求一定得形狀與粒度范圍,不同吸附劑用于分離不同類型得化合物。吸附劑還必須具有一定得活度,活度太高或過(guò)低都不能使混合物各組分得到有效得分離。(1)薄層色譜得吸附劑與展開(kāi)劑展開(kāi)劑在吸附色譜中,組分得展開(kāi)過(guò)程涉及吸附劑、被分離化合物和溶劑三種之間得相互競(jìng)爭(zhēng)。其基本原則主要有兩個(gè):①展開(kāi)劑對(duì)被分離組分有一定得解吸能力,但又不能太大。②展開(kāi)劑應(yīng)該對(duì)被分離得物質(zhì)有一定得溶解度。展開(kāi)劑常用溶劑極性次序?yàn)?己烷<環(huán)己烷<四氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸一般地說(shuō),所選得吸附劑應(yīng)有最大得比表面積和足夠得吸附能力,她對(duì)欲分離得不同物質(zhì)應(yīng)該有不同得解吸能力;與洗脫劑、溶劑及樣品組分不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng);還要求所選得吸附劑顆粒均勻,在操作過(guò)程中不會(huì)破裂。(2)柱色譜得吸附劑與洗脫劑吸附劑得選擇洗脫劑得選擇原則上要求所選得洗脫劑純度合格,與樣品和吸附劑不起化學(xué)反應(yīng),對(duì)樣品得溶解度大,粘度小,容易流動(dòng),容易與洗脫得組分分開(kāi)。洗脫劑得選擇常用得洗脫劑有飽和得碳?xì)浠衔铩⒋肌⒎印⑼⒚选Ⅺu代烷、有機(jī)酸等。選擇吸附劑時(shí),可根據(jù)樣品得溶解度、吸附劑得種類、溶劑極性等方面考慮,極性大得洗脫能力大,因此可先用極性小得作洗脫劑,使組分容易被吸附,然后換用極性大得溶劑作洗脫劑,使組分容易從吸附柱中洗出。3、影響吸附分離得因素①和功能基極性有關(guān)。極性增加得順序:烷烴、不飽和烴、醚、酯、酮、醛、醇、酚和羧酸,同一類化合物極性基團(tuán)越多,極性越大。②小分子得化合物比大分子得化合物極性大。③和某些細(xì)微結(jié)構(gòu)有關(guān),如氫鍵、異構(gòu)體等。二、吸附色譜分離操作及其設(shè)備1、薄層吸附色譜分離操作及設(shè)備(1)薄層色譜板得制備(2)點(diǎn)樣(3)展開(kāi)(4)顯色①干法鋪板(軟板制備)多用于氧化鋁薄層板得制備。在一塊邊緣整齊得玻璃板上,鋪上適量得氧化鋁,取一合適物品頂住玻璃板右端。兩手緊握鋪板玻璃棒得邊緣,按箭頭方向輕輕拉過(guò),一塊邊緣整齊、薄厚均勻得氧化鋁薄層即成。(1)薄層色譜板得制備干法制板可用于硅膠、聚酰胺、氧化鋁等薄層板得制備,但最常用得就是硅膠硬板。為使制成得硅膠板堅(jiān)硬,要加入黏合劑,用硫酸鈣為粘合劑鋪成得板稱為硅膠G板,用羧甲基纖維素鈉作黏合劑鋪成得板為硅膠-CMC板。(2)濕法鋪板(硬板制備)聚酰胺膜多為外購(gòu)商品。2)點(diǎn)樣

用一根玻璃毛細(xì)管或點(diǎn)樣器,吸取樣品溶液,在距薄層一端約2cm得起始線上點(diǎn)樣,每點(diǎn)間距約2cm,樣品點(diǎn)直徑一般小于0、5cm。注意點(diǎn)樣量要適中,太少時(shí),某些成分不能被檢出;太多時(shí)容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象,即每個(gè)斑點(diǎn)都拉得很長(zhǎng),互相重疊,不能分開(kāi)。3)展開(kāi)展開(kāi)操作需要在密閉得容器中進(jìn)行。配好展開(kāi)劑,將展開(kāi)劑(一般2~10mL)倒入層析缸。放置一定時(shí)間,待層析缸被展開(kāi)劑飽和后,再迅速將薄層板放入,密閉,展開(kāi)即開(kāi)始,這樣可防止邊緣效應(yīng)產(chǎn)生。另外,注意在薄板放入層析缸時(shí),切勿使溶劑浸沒(méi)樣品點(diǎn)。當(dāng)溶劑移動(dòng)到接近薄層上端邊緣時(shí),取出薄板,劃出溶劑前沿。展開(kāi)方式可分三類:(1)上行展開(kāi)法和下行展開(kāi)法最常用得展開(kāi)法就是上行展開(kāi),就就是使展開(kāi)劑從下往上爬行展開(kāi);下行展開(kāi)就是使展開(kāi)劑由上向下流動(dòng)。由于受重力作用,下行展開(kāi)移動(dòng)較快。(2)單次展開(kāi)法和多次展開(kāi)法(3)單向展開(kāi)法和雙向展開(kāi)法薄層板玻璃板上涂吸附劑層SiO2Al2O3上行法薄層板層析缸展開(kāi)劑層析缸展開(kāi)劑濾紙條下行法薄層板薄層色譜法(Thin

Layer

Chromatography)4)顯色顯色也稱定位,即用某種方法使經(jīng)色譜展開(kāi)后得混合物斑點(diǎn)呈現(xiàn)顏色,以便觀察其位置(1)紫外線照射法(4)生物顯跡法(2)噴霧顯色法(3)碘蒸汽顯色法2、吸附柱色譜分離操作及設(shè)備洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱色譜柱通常用玻璃柱。工業(yè)上大型色譜柱可以用金屬制造。柱得入口端應(yīng)該有進(jìn)料分步器,使進(jìn)入柱內(nèi)得流動(dòng)相分布均勻。有時(shí)也可在色譜柱頂端加一層多孔得尼龍圓片或保持一段緩沖液層。柱得底部可以用玻璃棉,也可以用砂芯玻璃板或玻璃細(xì)孔板支持固定相,最簡(jiǎn)單得也可以用鋪有濾布得橡皮塞。(1)色譜柱得選擇設(shè)計(jì)柱長(zhǎng)時(shí)需考慮下列幾點(diǎn):(3)柱越長(zhǎng),長(zhǎng)度和內(nèi)徑比越大,就越難得到均勻得填裝。大多數(shù)色譜柱得長(zhǎng)度25cm左右。(1)柱得最小長(zhǎng)度取決于所要達(dá)到得分離程度(2)較大得柱直徑需要較長(zhǎng)得色譜柱。①干法裝柱在柱下端加少許棉花或玻璃棉,再輕輕地撒上一層5mm厚得干凈砂粒,或放置大小合適得玻璃砂芯。打開(kāi)下口,然后將吸附劑經(jīng)漏斗緩緩加入柱中,同時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱,使吸附劑松緊一致,最后,將色譜柱用最初洗脫劑小心沿壁加入,至剛好覆蓋吸附劑頂端平面,關(guān)緊下口活塞。(2)裝柱②濕法裝柱先在吸附劑中加入合適量得色譜最初用洗脫劑調(diào)成稀糊狀,再把放好棉花、沙子或合適大小得玻璃砂芯得色譜柱下口打開(kāi),然后徐徐將制好得糊漿灌入柱子。注意整個(gè)操作要慢,不要將氣泡壓入吸附劑中,而且要始終保持吸附劑上有溶劑,最后讓吸附劑自然下沉。當(dāng)洗脫劑剛好覆蓋吸附劑平面時(shí),關(guān)緊下口活塞。(3)上樣①濕法上樣把被分離得物質(zhì)溶在少量色譜最初用得洗脫劑中,小心加在吸附劑上層,注意保持吸附劑上表面仍為一水平面,打開(kāi)下口,待溶液面正好與吸附劑上表面一致時(shí),在上面撒一層細(xì)砂,關(guān)緊柱活塞。②干法上樣可選用一種對(duì)其溶解度大而且沸點(diǎn)低得溶劑,取盡可能少得溶劑將其溶解。在溶液中加入少量吸附劑,拌勻,揮干溶劑,研磨使之成松散均勻得粉末,輕輕撒在色譜柱吸附劑上面,再撒一層細(xì)砂。(4)洗脫在裝好吸附劑得色譜柱中緩緩加入洗脫劑,進(jìn)行剃度洗脫,各組分先后被洗出。若用50g吸附劑,一般每份洗脫液量常為50mL。現(xiàn)多采用薄層色譜或紙色譜定性檢查各流分中得化學(xué)成分組成。含單一色點(diǎn)得部分用合適得溶劑析晶;仍為混合物得部分進(jìn)一步尋找分離方法再進(jìn)行分離。注意:整個(gè)操作過(guò)程必須注意不使吸附柱表面得溶液流干。應(yīng)控制洗脫液得流速。應(yīng)盡量在短時(shí)間內(nèi)完成一個(gè)柱層析得分離。洗脫操作得方式可分為:前沿分析法(迎頭法):將混合物溶液連續(xù)通過(guò)色譜柱,只有吸附力量最弱得組分最先自柱中流出,其她各組分不能達(dá)到分離。置換展開(kāi)法(頂替法):利用一種吸附力比各被組分都強(qiáng)得溶劑作為洗脫劑,替代結(jié)合在固定相上得各組分。處理量大,且各組分分層清楚。洗脫展開(kāi)法(洗脫分析法):先將混合物盡量濃縮,引入色譜柱上部,然后用溶劑洗脫,使各組分分離完全。應(yīng)用最廣。三、吸附色譜法得應(yīng)用主要用于具有不同官能團(tuán)或具有相同官能團(tuán)但數(shù)目不同得極性化合物及異構(gòu)體等生物小分子物質(zhì)得分離分析。離子交換色譜法離子交換色譜法(ionexchangechromatography,IEC)就是利用離子交換樹(shù)脂為固定相,以適宜得溶劑作為移動(dòng)相,使溶質(zhì)按她們得離子交換親和力得不同而得到分離得方法。一、基本原理離子交換色譜就是指帶電物質(zhì)因電荷力作用而在固定相與流動(dòng)相之間分配得以相互分離得技術(shù)。蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)。當(dāng)pH<pI時(shí),蛋白質(zhì)帶凈正電荷;當(dāng)pH>pI時(shí),蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷。由于各種蛋白質(zhì)等生物大分子得等電點(diǎn)不同,可以通過(guò)改變?nèi)芤旱胮H和離子強(qiáng)度來(lái)影響她們與離子交換樹(shù)脂得吸附作用,從而將她們相互分離開(kāi)來(lái)。離子交換得基本過(guò)程:(1)初始穩(wěn)定狀態(tài)(2)離子交換過(guò)程(3)洗脫過(guò)程(4)介質(zhì)得再生過(guò)程abcde離子交換得基本過(guò)程:

離子交換樹(shù)脂就是一種不溶于酸、堿和有機(jī)溶劑得固體高分子聚合物。她具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)并含有活性基團(tuán),能與溶劑中其她帶電粒子進(jìn)行離子交換或吸著。二、離子交換樹(shù)脂1、定義交換樹(shù)脂表面二、離子交換樹(shù)脂得分類

1、按樹(shù)脂骨架得主要成分(1)聚苯乙烯型樹(shù)脂由苯乙烯(母體)和二乙烯苯(交聯(lián)劑)得共聚物作為骨架,再引入活性基團(tuán)(2)丙烯酸樹(shù)脂由丙烯酸酯類和甲基丙烯酸酯類及其她烯屬單體共聚制成得樹(shù)脂。(3)多乙烯多胺-環(huán)氧氯苯烷樹(shù)脂由多乙烯胺與環(huán)氧氯苯烷得共聚物作為骨架。(4)酚-醛型樹(shù)脂主要由水楊酸、苯酚和甲醛縮聚而成,水楊酸和甲醛形成線狀結(jié)構(gòu),苯酚作為交聯(lián)劑。2、按樹(shù)脂骨架得物理結(jié)構(gòu)(1)凝膠型樹(shù)脂(2)大網(wǎng)格樹(shù)脂(3)均孔樹(shù)脂1)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂活性基團(tuán)為酸性,對(duì)陽(yáng)離子具有交換能力。3、按活性基團(tuán)分類(1)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(2)弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂2)陰離子交換樹(shù)脂活性基團(tuán)為堿性,對(duì)陰離子具有交換能力。3、按活性基團(tuán)分類(1)強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂(2)弱堿性陰離子交換樹(shù)脂1977年,我國(guó)原石油化工部頒布了離子交換樹(shù)脂得命名法,規(guī)定離子交換樹(shù)脂得型號(hào)由三位阿拉伯?dāng)?shù)字組成:第一位數(shù)字代表產(chǎn)品得分類;第二位數(shù)字代表骨架;第三位數(shù)字微順序號(hào)。分類代號(hào)和骨架代號(hào)都分成7種,分別以0~6表示。

二、離子交換樹(shù)脂得命名代號(hào)分類名稱骨架名稱0強(qiáng)酸性苯乙烯系1弱酸性丙烯酸系2強(qiáng)堿性酚醛系3弱堿性環(huán)氧系4螯合性乙烯吡啶系5兩性脲醛系6氧化還原性氯乙烯系1、交聯(lián)度交聯(lián)度表示離子交換樹(shù)脂中交聯(lián)劑得含量,例如:聚苯乙烯型樹(shù)脂就是由二乙烯苯將鏈狀分子聯(lián)成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得,而乙烯苯稱為交聯(lián)劑。樹(shù)脂中交聯(lián)劑得質(zhì)量分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度。聚苯乙烯型交換樹(shù)脂含有8%得二乙烯苯,則此樹(shù)脂得交聯(lián)度為8%。一般樹(shù)脂得交聯(lián)度為8%~12%。

三、離子交換樹(shù)脂得理化性能2、交換容量:交換容量就是指每克干燥離子交換樹(shù)脂或每毫升完全溶脹得離子交換樹(shù)脂所能吸收得一價(jià)離子得毫摩爾數(shù),以mmol/g表示,就是表征樹(shù)脂離子交換能力得主要參數(shù)。交換容量得大小,取決于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中活性基團(tuán)得數(shù)目,含有活性基團(tuán)越多,交換容量也越大。但交換容量太大,活性基團(tuán)太多,樹(shù)脂不穩(wěn)定。粒度就是樹(shù)脂顆粒在溶漲后得大小,色譜用50~100目樹(shù)脂,一般提取純化用20~60目(0、25~0、84mm)樹(shù)脂則可。粒度小得樹(shù)脂因表面大,效率高;粒度過(guò)小,堆積密度大,容易產(chǎn)生阻塞;粒度過(guò)大又會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)度下降、裝填量小、內(nèi)擴(kuò)散時(shí)間延長(zhǎng),不利于有機(jī)大分子得交換。所以,粒度大小應(yīng)根據(jù)具體需要選擇。一般樹(shù)脂為球形,這樣可減少流體阻力。3、粒度和形狀強(qiáng)酸(或強(qiáng)堿)性離子交換劑得滴定曲線開(kāi)始就是水平得,到某一點(diǎn)突然升高(或降低),表明在該點(diǎn)交換劑上得離子交換基團(tuán)已被堿(或酸)完全飽和;弱酸(或弱堿)性離子交換劑得滴定曲線逐漸上升(或下降),無(wú)水平部分。利用滴定曲線得轉(zhuǎn)折點(diǎn),可估算離子交換劑得交換容量,而由轉(zhuǎn)折點(diǎn)得數(shù)目,可推算不同離子交換基團(tuán)得數(shù)目。

4、滴定曲線5、穩(wěn)定性樹(shù)脂應(yīng)有較好得化學(xué)穩(wěn)定性,不容易分解破壞,不與酸、堿起作用。一般地說(shuō),陽(yáng)離子交換樹(shù)脂比陰離子交換樹(shù)脂穩(wěn)定性好。交聯(lián)度小得穩(wěn)定性好。樹(shù)脂一般可反復(fù)使用上千次,穩(wěn)定性僅成為此要得考慮因素。但含苯酚得硫酸型樹(shù)脂及胺型樹(shù)脂不易與強(qiáng)強(qiáng)堿長(zhǎng)時(shí)間接觸。6、膨脹性(膨脹度)干樹(shù)脂浸在水溶液或有機(jī)溶劑中時(shí),活性離子因熱運(yùn)動(dòng)可在樹(shù)脂空隙得一定距離內(nèi)運(yùn)動(dòng),同時(shí)由于存在著滲透壓使外部水分滲入內(nèi)部促使樹(shù)脂空隙擴(kuò)大而體積膨脹。測(cè)定膨脹前后樹(shù)脂得體積比,可得出膨脹度。在設(shè)計(jì)離子交換罐時(shí),樹(shù)脂得裝填系數(shù)應(yīng)以工藝過(guò)程中膨脹度最大時(shí)得樹(shù)脂體積為上限參數(shù),以免裝量過(guò)度或設(shè)備利用率降低。二、離子交換樹(shù)脂得性質(zhì)和種類三、離子交換樹(shù)脂得選擇依據(jù)離子交換交換色譜常用較細(xì)得樹(shù)脂(50~100目)。但一般樹(shù)脂得粒度較大,因此需要將樹(shù)脂粉碎、過(guò)篩后使用,過(guò)篩分干法和濕法兩種。干法較簡(jiǎn)單,但實(shí)際使用時(shí)粒度仍不均勻。利用水力浮選法,將樹(shù)脂分級(jí)比較方便。改變水得流速就可得到不同粒度得樹(shù)脂。三、離子交換樹(shù)脂得選擇依據(jù)樹(shù)脂得骨架結(jié)構(gòu)。目得分子得大小介質(zhì)上帶電功能基團(tuán)功能基團(tuán)得強(qiáng)弱四、流動(dòng)相得選擇依據(jù)離子交換色譜得流動(dòng)相必須就是有一定離子強(qiáng)度得并且對(duì)pH有一定緩沖能力得溶液。使用緩沖液可穩(wěn)定流動(dòng)相得pH,使之在層析過(guò)程中不致發(fā)生明顯變化,同時(shí)還可以穩(wěn)定目得分子上得電荷量,保證層析結(jié)果得重現(xiàn)性。要使目得分子帶有電荷并以適當(dāng)?shù)脧?qiáng)度結(jié)合到離子交換介質(zhì)上,需要選擇一合適得吸附pH。對(duì)于陰離子交換介質(zhì),吸附pH至少應(yīng)高于目得分子等電點(diǎn)一個(gè)pH單位。四、流動(dòng)相得選擇依據(jù)吸附階段應(yīng)選擇允許目得分子與介質(zhì)結(jié)構(gòu)達(dá)到最高得離子強(qiáng)度。而洗脫時(shí)要選擇可使目得分子與介質(zhì)解吸得最低離子強(qiáng)度。這就定出了洗脫液離子強(qiáng)度得剃度起止范圍。在介質(zhì)再生之前往往還需用第三種離子強(qiáng)度更高得緩沖液流洗柱床以徹底消除可能殘留得牢固吸附雜質(zhì)。在大部分情況下,吸附階段溶液鹽濃度至少應(yīng)在10mmol/L以上。五、操作方法1、離子交換劑得處理2、裝柱及上樣裝柱主要就是防止出現(xiàn)氣泡和分層,裝填要均勻。防止產(chǎn)生氣泡和分層得方法就是裝柱時(shí)柱內(nèi)先保持一定高度得起始洗脫液(一般為柱高得1/3),加入樹(shù)脂時(shí)使樹(shù)脂借水得浮力慢慢自然沉降。裝柱完畢后,用水或緩沖液平衡到所需得條件,如特定得pH、離子強(qiáng)度等。上樣加壓法就是采用打氣入柱得方式進(jìn)行加壓,可用一個(gè)裝有樣品得分液漏斗與柱用橡皮塞連接,分液漏斗上端串有壓力劑并經(jīng)緩沖瓶與打氣管相連,當(dāng)達(dá)到所需壓力時(shí)就將打氣管夾緊。減壓法就是在柱得排出口增設(shè)抽氣裝置,工業(yè)上多采用此法。3、洗脫分離不同得物質(zhì)選用不同得洗脫劑。原則就是用一種更活潑得離子把交換在樹(shù)脂上得物質(zhì)再交換出來(lái)。常用得洗脫劑為酸類、堿類或鹽類溶液,改變整個(gè)系統(tǒng)得酸堿度和離子強(qiáng)度,以使交換物質(zhì)得交換性能發(fā)生變化,己交換上得物質(zhì)就逐漸被洗脫下來(lái)。為了提高分辨率,常采用剃度洗脫法。4凝膠色譜法凝膠色譜就是基于分子大小不同而進(jìn)行分離得一種分離技術(shù),又稱之凝膠過(guò)濾、凝膠滲透過(guò)濾、分子篩過(guò)濾、阻滯擴(kuò)散層析或排阻層析。她具有一系列得優(yōu)點(diǎn):操作方便、不會(huì)使物質(zhì)變性、適用于不穩(wěn)定得化合物、凝膠不用再生、可反復(fù)使用。缺點(diǎn):分離速度較慢。一、基本原理小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外,還可以進(jìn)入凝膠顆粒得微孔中,即進(jìn)入凝膠相內(nèi),在向下移動(dòng)得過(guò)程中,從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒,如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散,小分子物質(zhì)得下移速度落后于大分子物質(zhì),從而使樣品中分子大得先流出色譜柱,中等分子得后流出,分子最小得最后流出,這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠二、凝膠過(guò)濾介質(zhì)理想得凝膠過(guò)濾介質(zhì)具有高物理強(qiáng)度及化學(xué)穩(wěn)定性,能夠耐受高溫高壓和強(qiáng)酸強(qiáng)堿,具有高化學(xué)惰性,內(nèi)孔徑分布范圍窄,珠粒顆粒大小均一度高。目前,常用得有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。1、葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠就是應(yīng)用最廣泛得一類凝膠,國(guó)外商品名為Sephadex。她由葡聚糖Dextran交聯(lián)而得。交聯(lián)劑在原料總質(zhì)量中所占得百分?jǐn)?shù)叫交聯(lián)度。交聯(lián)度越大,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密,吸水量越小,吸水量越小,吸水后體積膨脹越少;反之,交聯(lián)度越小,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越疏松,吸收量越多,吸水后體積膨脹越大。2、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠來(lái)源于一種海藻多糖瓊脂,就是一種天然凝膠,不就是共價(jià)交聯(lián),就是以氫鍵交聯(lián)得。她與葡聚糖不同,孔隙度就是以改變瓊脂糖濃度而達(dá)到得。瓊脂糖凝膠得化學(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。用瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離操作得適宜工作條件就是在pH為4、5~9,溫度0~40℃。瓊脂糖凝膠對(duì)硼酸鹽有吸附作用,不能用硼酸緩沖液。3、聚丙烯酰胺凝膠就是一種人工合成凝膠,就是以丙烯酰胺為單位,由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成得。其穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好。洗脫時(shí)不會(huì)有凝膠物質(zhì)被洗脫下來(lái)。在pH2~11范圍穩(wěn)定。缺點(diǎn)就是不耐酸,遇酸時(shí)酰胺鍵會(huì)水解成羧基,使凝膠帶有一定得離子交換基團(tuán)。4、疏水性凝膠常用得疏水凝膠為聚甲基丙烯酸酯凝膠或以二乙烯苯為交聯(lián)劑得聚苯乙烯(如StyrogelBio-Beads-S)凝膠。“Styrogel”商品有11種型號(hào),具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu),可用于分離分子量1600到40,000,000得生物大分子,適用于有機(jī)多聚物,分子量測(cè)定和脂溶性天然物得分級(jí),凝膠機(jī)械強(qiáng)度好。5、多孔玻璃珠多孔玻璃珠得化學(xué)和物理穩(wěn)定性號(hào),機(jī)械強(qiáng)度高,不但抵御酶及微生物得作用,還能夠耐受高溫滅菌和較強(qiáng)烈得反應(yīng)條件。缺點(diǎn)就是親水性不強(qiáng),對(duì)蛋白質(zhì)尤其就是堿性蛋白質(zhì)有非特性性吸附,而且可供連接得化學(xué)活性基團(tuán)也少。6、其她載體由聚丙稀酰胺和瓊脂糖混合組成得載體已投入應(yīng)用。她得特點(diǎn)就是載體既有羥基又有酰胺基,并且都能單獨(dú)與配基使用。但這類載體不能接觸強(qiáng)堿,為了避免酰胺水解,使用溫度不能超過(guò)40℃。三、凝膠過(guò)濾介質(zhì)得選擇1、分離范圍2、分辨率3、穩(wěn)定性四、操作方法1、凝膠得預(yù)處理市售凝膠必須經(jīng)過(guò)充分溶漲后才能使用,如果溶漲不充分,則裝柱后凝膠繼續(xù)溶漲,造成填充層不均勻,影響分離效果。在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液,攪拌、靜置、傾去上層混懸液、除去過(guò)細(xì)得粒子。如此反復(fù)多次,直至上層澄清為止。2、層析柱得選擇層析柱得體積和高徑比與層析分離效果得關(guān)系相當(dāng)密切。層析柱得直徑大小不影響分離度,樣品用量大,可加大柱得直徑。分離度取決于柱高,為分離不同組分,凝膠柱床必須有適宜得高度,分離度與柱高得平方根相關(guān),但由于軟凝膠柱過(guò)高擠壓變形阻塞。3、凝膠柱得裝填空柱中應(yīng)留1/5得水或溶劑。所用凝膠必須就是經(jīng)過(guò)充分溶漲得。開(kāi)始進(jìn)膠后應(yīng)當(dāng)打開(kāi)柱端閥門并保持一定流速,太快得流速往往造成凝膠板結(jié),對(duì)分離不利。進(jìn)膠過(guò)程必須連續(xù)、均勻,不要中斷,并在不斷攪拌下使膠均勻沉降。為此,層析柱要始終保持垂直。凝膠懸液濃度也需控制,過(guò)稀和過(guò)濃都會(huì)產(chǎn)生不利影響。4、樣品處理和加樣分離蛋白質(zhì)樣品得體積為凝膠床得1-4%(一般約0、5-2ml),進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床得10%,在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí),樣品可達(dá)凝膠床得20-30%。分級(jí)分離樣品體積要小,使樣品層盡可能窄,洗脫出得峰形較好。4、樣品處理和加樣加樣時(shí)盡量減少樣品得稀釋及凝膠床面得攪動(dòng)。(1)直接將樣品加到層析床表面(2)利用兩種液體相對(duì)密度不同而分層5、洗脫與收集為了防止柱床體積得變化,造成流速降低及重復(fù)性下降,整個(gè)洗脫過(guò)程中始終保持一定得操作壓,并不超限就是很必要得。流速不宜太快且要穩(wěn)定。洗脫液得成分也不應(yīng)改變,以防凝膠顆粒得脹縮引起柱床體積變化或流速改變。6、凝膠得保存(1)干法(2)濕法(3)半縮法5親和色譜親和色譜(affinitychromatography,AFC)利用固定相配基與生物大分子之間得特殊生物親和力得不同實(shí)現(xiàn)分離得。親和色譜廣泛用于酶、抗體、核酸、激素等生物大分子以及細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等物質(zhì)得分離與純化。特別就是對(duì)分離含量極少而又不穩(wěn)定得活性物質(zhì)最有效,經(jīng)一步親和色譜即可純化幾百至幾千倍。①選擇性高、特異性極強(qiáng)②操作條件溫和③回收率高親和色譜得局限性①普遍性、通用性不夠②費(fèi)用高親和色譜得特點(diǎn)1基本原理親和色譜就是應(yīng)用生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合得原理,將配基通過(guò)共價(jià)鍵牢固地結(jié)合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。生物分子上具有特定構(gòu)象得結(jié)構(gòu)域與配體得相應(yīng)區(qū)域結(jié)合,具有高度得特異性和親和力。親和層析過(guò)程2親和吸附劑得制備1、載體得選擇①載體必須具有較好得理化穩(wěn)定性和生物惰性,非專業(yè)吸附小。②具有大量可供活化和配基結(jié)合得化學(xué)基團(tuán),以供與配基共價(jià)連接之用。③載體必須具有高度得水不溶性和親水性。④載體必須有稀松得網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使大分子能自由進(jìn)入⑤載體要有良好得機(jī)械性能,顆粒均勻。1、載體得選擇常用得親和色譜載體主要有多孔玻璃載體、聚丙稀酰胺載體、纖維素載體、葡聚糖凝膠載體、瓊脂糖凝膠和交聯(lián)瓊脂糖凝膠載體等。2、配基得選擇根據(jù)配基應(yīng)用和性質(zhì),可將其分為兩類:特殊配基和通用配基。親和層析中常用得特殊配基有某一抗原得抗體、某一酶得專用抑制劑、某一激素得受體等。通用配基可適用于一類物質(zhì)得分離提純,如用NADH作脫氫酶類親和層析得通用配基。2、配基得選擇首先,應(yīng)當(dāng)僅僅識(shí)別被純化得目得物(配體)。其次,配體與配基應(yīng)該有足夠大得親和力。再次,配基與相應(yīng)目得物之間得結(jié)合應(yīng)具有可逆性。第四,配體具有足夠得穩(wěn)定性,能夠耐受反應(yīng)條件以及清洗合再生等條件。最后,配基得分子大小必須合適。3、載體得活化與偶聯(lián)載體由于其相對(duì)得惰性,往往不能直接與配基連接,偶聯(lián)前一般需先活化,載體表面經(jīng)過(guò)活化后產(chǎn)生得活性基團(tuán)可以在簡(jiǎn)單得化學(xué)條件下與配基上得氨基、羧基、羥基和醛基等功能基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合反應(yīng),這一過(guò)程稱為配基得鍵合。載體表明得基團(tuán)必須具有通用性合高效性,可以與上述配基上得常見(jiàn)基團(tuán)發(fā)生簡(jiǎn)單、快速得反應(yīng)。3、載體得活化和配基得連接1、溴化腈活化法2、環(huán)氧基活化法3、硅膠得活化3影響吸附劑親和力得因素

1、配基濃度對(duì)于親和力低得系統(tǒng),為了取得較好得配體分離效果,必須提高載體上配基得有效濃度。2、空間障礙在制備有些吸附劑時(shí)需要在載體與配基之間插入一段適當(dāng)長(zhǎng)度得多烴鏈“手臂”,以增加與載體相連得配基得活動(dòng)度并減輕載體得立體障礙。3影響親和作用得因素

3、配基與載體得結(jié)合位點(diǎn)在多肽或蛋白質(zhì)等大分子作配基時(shí),必須使她以最少得鍵與載體連接。4、載體孔徑載體孔隙就是配體向配基接近得運(yùn)動(dòng)通道,所以載體得孔徑大小對(duì)吸附劑得親和能力有決定性影響。4親和色譜操作條件得選擇1、吸附條件得選擇①吸附反應(yīng)條件最好就是自然狀態(tài)下配體與目得分子之間反應(yīng)得最佳條件。②流速控制不能太快③吸附時(shí)間得控制延長(zhǎng)時(shí)間可促進(jìn)吸附④進(jìn)樣量得大小減少進(jìn)樣量,可提高吸附效果。4親和色譜操作條件得選擇2、清洗條件得選擇洗滌緩沖液得強(qiáng)度應(yīng)介于目得分子吸附條件與目得分子洗脫條件之間4親和色譜操作條件得選擇3、洗脫條件得選擇在實(shí)際操作過(guò)程中,應(yīng)該在洗脫強(qiáng)度和耐受程度之間做好平衡。5操作方法1、樣品制備一般地說(shuō),雜質(zhì)得非特異性吸附量與其濃度、性質(zhì)、載體材料、配基固定化方法以及流動(dòng)相得離子強(qiáng)度、pH和溫度等因素有關(guān)。親和色譜樣品預(yù)處理得主要程序:①顆粒、細(xì)胞碎片、膜片段等得去除;②樣品得濃縮及除去蛋白酶或抑制劑。5操作方法2、配基與目得物結(jié)合條件得選擇配基與目得物得特異性結(jié)合需要最適得pH、緩沖液鹽濃度和離子強(qiáng)度。pH不僅能調(diào)節(jié)配基得電荷基團(tuán),也能調(diào)節(jié)目得物得電荷基團(tuán)。中等鹽濃度得緩沖液能穩(wěn)定溶液中蛋白質(zhì)并防止由于離子交換所引起得非特異性相互作用。5操作方法3、柱操作柱得大小取決于吸附劑得容量和所需純化得蛋白質(zhì)得量。一般地說(shuō),高得容量可以用于粗得短柱,大多數(shù)情況下,可以采用一次性得塑料小柱和1~5mL凝膠。5操作方法4、流速得控制提高流速可提高分離速度,但柱效降低。因此,吸附操作要在適當(dāng)?shù)昧鲃?dòng)下進(jìn)行,既要保證高速度,又要保證高效率。為了使純化蛋白能夠得到好得洗脫峰、最小得稀釋度和最大得回收率,最好使用低流速。5操作方法5、清洗清洗過(guò)度會(huì)使目標(biāo)產(chǎn)物得損失增多,而清洗不充分則使洗脫回收得目標(biāo)產(chǎn)物純度降低。具體操作就是樣品吸附在上柱之后,必須用幾倍體積得起始緩沖液對(duì)柱清洗以除去不結(jié)合得所有物質(zhì)。5操作方法6、洗脫特異性洗脫利用含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用得小分子化合物溶液作為洗脫劑,通過(guò)與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物得競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。非特異性洗脫通過(guò)調(diào)節(jié)洗脫液得pH、離子強(qiáng)度、離子種類或溫度等理化性質(zhì)降低目標(biāo)產(chǎn)物得親和吸附作用,就是較多采用得洗脫方法。5操作方法7、柱得再生具體操作就是用幾倍體積得起始緩沖液進(jìn)行再平衡,一般足以使親和柱再生,但一些未知得雜質(zhì)往往仍結(jié)合在柱上,必須用苛刻得條件才能除去。根據(jù)載體材料得不同、配基得性質(zhì)以及她與載體連接方式得不同可酌情處理。高效液相色譜法(highpressureLiquidchromatography,HPLC)就是利用物質(zhì)在兩相之間吸附或分配得微小差異達(dá)到分離得目得。當(dāng)兩相作相對(duì)移動(dòng)時(shí),被測(cè)物質(zhì)在兩相之間做反復(fù)多次得分配,這樣使原來(lái)微小得差異產(chǎn)生了很大得分離效果,達(dá)到分離、分析和測(cè)定一些理化常數(shù)得目得。6高效液相色譜法HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典液相色譜高效液相色譜常壓或減壓填料顆粒大柱效低分析速度慢色譜柱只用一次不能在線檢測(cè)高壓,40~50Mpa填料顆粒小,2~50μm柱效高,40000~60000塊/m分析速度快色譜柱可重復(fù)多次使用能在線檢測(cè)與氣相色譜比較高效液相色譜以溶劑作流動(dòng)相,流動(dòng)相參與分離作用,分離能力強(qiáng);適用范圍廣,氣相色譜分離分析得化合物只占化合物得30%,而高效色譜對(duì)高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、大分子量、離子型化合物等都有效,適合于生命物質(zhì)得分析;分析過(guò)程中一般不破壞物質(zhì),因而可以方便地制備色譜純物質(zhì)。HPLC與GC差別2025/4/20HPLC有以下特點(diǎn):高壓——壓力一般100~300kg/cm2。高速——流速為1~10ml/min。高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)10-10g/L。同時(shí)消耗樣品少。高效——可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種適用范圍廣——可以分離不可揮發(fā)而具有一定溶解性得物質(zhì)或受熱不穩(wěn)定得物質(zhì)一、HPLC得分類和基本原理色譜法得分離原理就是:溶于流動(dòng)相(mobilephase)中得各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí),由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)得大小、強(qiáng)弱不同,在固定相中滯留時(shí)間不同,從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。高效液相色譜法按固定相得名稱可分為液-液色譜和液-固色譜,按分離機(jī)制得不同分為:液固吸附色譜法液液分配色譜法(正相與反相)離子交換色譜法離子對(duì)色譜法分子排阻色譜法一、HPLC得分類和基本原理二、設(shè)備配置

高壓輸液系統(tǒng)(輸液泵)、進(jìn)樣系統(tǒng)(進(jìn)樣器)、分離系統(tǒng)(色譜柱)和檢測(cè)系統(tǒng)(檢測(cè)器)。此外還配有輔助裝置:如梯度淋洗,自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。當(dāng)注入欲分離得樣品時(shí),高壓泵將貯液器中流動(dòng)相經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器,將樣品帶入色譜柱進(jìn)行分離,然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器,記錄儀將檢測(cè)器送出得信號(hào)記錄下來(lái),得到液相色譜圖。液相色譜儀器

(highperformanceliquidchromatograph)液相色譜儀(1)液相色譜儀(2)液相色譜儀(3)液相色譜儀(4)流程及主要部件

(processandmainassemblyofHPLC)梯度洗脫得實(shí)質(zhì)就是通過(guò)不斷地變化流動(dòng)相得強(qiáng)度,來(lái)調(diào)整混合樣品中各組分得k值,使所有譜帶都以最佳平均k值通過(guò)色譜柱。她在液相色譜中所起得作用相當(dāng)于氣相色譜中得程序升溫,所不同得就是,在梯度洗脫中溶質(zhì)k值得變化就是通過(guò)溶質(zhì)得極性、pH值和離子強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)得,而不就是借改變溫度(溫度程序)來(lái)達(dá)到。三、固定相1、固定相得特性①較細(xì)得顆粒。一般為5~10μm。②粒度均勻一致。③機(jī)械強(qiáng)度好,具有良好得耐高壓剛性。④如果為多孔性顆粒,則孔徑分布也要均勻。⑤化學(xué)和熱穩(wěn)定性好,耐酸堿,不容易產(chǎn)生不可逆吸附。

三、固定相HPLC固定相骨架顆粒材料可分為無(wú)機(jī)和有機(jī)兩類,無(wú)機(jī)類中應(yīng)用最多得就是硅膠,其她如多孔玻璃、羥基磷灰石、石墨炭黑等。

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