ICS65.020.30DB12B44天津市地方標準DB12/T863—2019水產微生態制劑解淀粉芽胞桿菌生產技術規程Aquaticprobiotics---TechnicalregulationforproductionofBacillusamyloliquefaciens天津市市場監督管理委員會發布DB12/T863—2019前言本標準依據GB/T1.1—2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫》的要求起草。本標準由天津市農業科學院提出并歸口。本標準起草單位：天津市農業生物技術研究中心。本標準主要起草人：謝鳳行、張峰峰、周可、趙瓊、趙玉潔、孫海波、高寶山。IDB12/T863—2019水產微生態制劑解淀粉芽胞桿菌生產技術規程12范圍本標準規定了解淀粉芽胞桿菌生產中所涉及的生產環境和設備、生產技術流程、質量檢測和儲運。本標準適用于水產微生態制劑解淀粉芽胞桿菌的生產。規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB3095GB3838GB20287環境空氣質量標準地表水環境質量標準農用微生物菌劑GB/T26428飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測3術語和定義解淀粉芽胞桿菌bacillusamyloliquefaciens屬于芽胞桿菌科，芽胞桿菌屬，桿狀，有鞭毛，革蘭氏陽性菌，芽胞橢圓形，中生或近中生。一級菌種firstclassstrain二級菌種secondclassstrain4發酵用水符合地表水環境質量標準GB3838中Ⅲ類水質要求，冷卻水及其他用水符合該標準中1DB12/T863—20194.2生產設備生產設備需為不銹鋼發酵罐，體積根據生產規模自定。5生產技術流程5.1生產流程生產技術流程見附錄A菌種質量5.25.2.15.2.25.2.3用于發酵的菌種應有菌種鑒定報告或菌株來源相關信息。在發酵前應先檢測菌種的純度和性能，如不純或退化，應先進行提純復壯。菌種在上罐生產之前需檢測種子罐中菌體的純度和濃度，不能有雜菌污染，濃度達到每毫升億級以上。5.3培養基5.3.15.3.25.3.3料。原菌種和一級菌種的培養基應保證菌種生長的延滯期短，生長旺盛，碳、氮源營養豐富。二級菌種培養基原則上為發酵培養基或接近發酵培養基。發酵培養基在保證菌體生長旺盛，利于芽胞形成的前提下，盡量利用來源充足、價格低廉的原液體發酵，發酵罐的裝液量50%～70%，液體培養基、發酵設備、管道、補料罐等采用高壓蒸汽滅菌后無菌操作取滅菌后的培養基，制片，染色，鏡檢，無微生物說明滅菌徹底，若有，需重搖瓶種子到發酵罐種子接種量為1%～5%，種子罐到發酵罐接種量為5%～7%。接種保證無菌操作，調3/h?t～20m/h?t，攪拌轉數80r/min～3發酵過程加入天然油脂類或有機硅類消泡劑，可采用蠕動泵添加，也可在配置培養基時加入。發酵后的液體菌劑直接分裝，或用沸石粉、凹凸棒土等載體吸附，載體的雜菌率≤1.0×104CFU/g，2DB12/T863—20196質量檢測6.1檢測指標每個批次的產品抽樣檢測包括感官、水分、有效活菌數、芽胞率、雜菌率等指標，檢驗合格方可出廠。6.2感官檢測6.2.16.2.2取液體菌劑約250mL（固體菌劑約250g）于無色玻璃杯中，采用目測、鼻嗅的方法進行檢驗。液體菌劑為淡黃色或棕黃色，存放過程中可能出現沉淀，具清淡的腥味；固體菌劑棕色或淺棕色，具有明顯的發酵氣味。6.3有效活菌數、芽胞率檢測樣品稀釋6.3.1液體菌劑用滅菌0.85%的生理鹽水梯度稀釋，固體菌劑稀釋方法按照GB26428規定執行。6.3.2涂平板有效活菌測定直接用2～3個梯度稀釋液（10、10、10）在含淀粉的培養基(參見附錄B)上涂平-6-7-8板，每個梯度涂3個平板，芽胞數則將2～3個梯度稀釋液80℃處理10min后在含淀粉的培養基(參見附錄B)上涂平板。將涂好的平板在室溫中放置15min，使接種物完全被瓊脂吸收，倒置于培養箱中37℃培養48h。選取菌落數在30～300個之間的平板計數，典型的解淀粉芽胞桿菌菌落表面粗糙，不透明，邊緣不規則，呈淺米黃色，消耗培養基中的淀粉在菌落周圍產生透明圈。芽胞數除以菌數即為芽胞率。從用來測定有效活菌數且已經過10倍系列稀釋的樣品中，選取10、10、103個稀釋度進行雜菌-5-6-7率測定。平板計數法，按GB20287執行。按GB20287執行。7應貯存在通風、干燥、清潔的倉庫，倉庫內無有害氣體、易燃易爆物品及有腐蝕性的化學物品，長途運輸時，防止日曬、雨淋，避免長期受壓和機械損傷。產品不應和易燃、易爆、易腐蝕的物A3DB12/T863—2019附錄A（規范性附錄）解淀粉芽胞桿菌生產技術流程圖配置培養基原菌種純度和性能檢查一級菌種滅菌接種發酵二級菌種無菌空氣發酵物檢測不合格不合格圖A.1解淀粉芽胞桿菌生產技術流程圖4DB12/T863—2019BB附錄B（資料性附錄）計數用培養基含淀粉培養基成分（每升培養基含量）:——可溶性淀粉：10g；——蛋白胨：10g；——硫酸鎂：0.5