ICS65.020.20DB12B04天津市地方標準DB12/T838—2018辣椒種子純度SSR分子標記鑒定方法MethodofidentifyingseedpurityofpepperbyusingSSR-basedmarker天津市市場和質量監督管理委員會發布DB12/T838—2018前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由天津市農村工作委員會提出并歸口。本標準起草單位：天津市農業質量標準與檢測技術研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所。本標準主要起草人：蘭青闊、呂敬剛、趙新、王成、蘭璞、焦荻、高素燕、陳銳、關海濤、張耀中、焦賀敏。IDB12/T838—2018辣椒種子純度SSR分子標記鑒定方法12范圍本標準規定了辣椒種子純度SSR分子標記鑒定方法的原理、儀器設備及試劑、方法步驟、純度計算。本標準適用于辣椒單交種的純度鑒定。規范性引用文件下列文件對于本標準的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。GB/T3543.2農作物種子檢驗規程扦樣GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。種子純度seedpurity種子在SSR分子標記帶型方面典型一致的程度，用具有本品種特異帶型的種子粒數占鑒定樣品種子聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction(PCR)由幾個核苷酸（1～6個）為重復單位聚集而成的長達幾十個至幾百個bp（一般為100～200）的串聯重復序列，又稱微衛星序列或短串聯重復序列，其高度多態性主要來源于串聯數目的不同。3.44SSR分布于辣椒整個基因組，每個位點上重復單位的數目不同造成了品種間的多態性，利用PCR技術將多態的SSR擴增出來，通過電泳檢測擴增產物，利用電泳圖譜進行辣椒種子純度鑒定。51DB12/T838—20185.1儀器設備PCR儀；測序電泳槽；水平電泳槽；高壓電泳儀（3000V，400mA，400W）；萬分之一電子天平；微量加樣器；磁力攪拌器；臺式離心機；紫外-可見成像系統；膠片觀察燈；水平搖床；高壓滅菌鍋；pH計等。5.2試劑乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；鹽酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸鈉（SDS）；氯化鈉（NaCl）；氫氧化鈉（NaOH）；硼酸；去離子甲酰胺；溴酚藍；二甲苯青FF；甲叉雙丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；親和硅烷；剝離硅烷；無水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；過硫酸銨；冰醋酸；硝酸銀；甲醛溶液（37%）；TaqDNA聚合酶（含Mg的10×PCR緩沖液）；四種脫氧核糖核苷酸2+（dNTPs）；SSR引物；瓊脂糖；GoldView染料；定性PCR試劑盒；DNA提取試劑盒；實驗用水為重蒸餾水或符合GB/T6682規定的一級水等。除特殊說明外，所用試劑均為分析純試劑。5.3溶液配制相關溶液配制方法見附錄A。6方法步驟6.1取樣檢測樣品的分樣和保存，應符合GB/T3543.2的規定，從中隨機取100粒以上種子，取其父母本材料各10份。在玻璃培養皿底部墊上一層厚度約3mm的棉花或濾紙，用水浸濕后均勻地撒上檢測樣品，再于表面覆蓋一層紗布，置于光照培養箱中。培養條件為16h35℃光照培養，8h28℃暗培養，待種子長出子葉后備用。取單株幼苗子葉，放入1.5mL離心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL離心管中。將DNA提取液預熱到65℃，每管放入400μL混合樣品，將離心管置于65℃金屬浴或水浴鍋中，保溫30min后取下，向離心管中加入400μL24:1氯仿-異戊醇（V:V），振蕩混勻。10000g離心10min。將上清液200μL轉入另一支1.5mL離心管，加入400μL-20℃預冷無水乙醇沉淀DNA。10000g離心1min，棄上清液，加入500μL乙醇——乙酸銨溶液，6000g離心5min收集沉淀。加入100μLTE（pH8.0）溶液溶解DNA。將DNA適當稀釋或濃縮，使其OD260值在0.1～0.8的區間內，測定并記錄其在260nm和280nm的吸光度。以1個OD260值相當于50mg/LDNA濃度來計算純化DNA的濃度，并進行DNA凝膠電泳檢測DNA完整性。DNA溶液的OD260/OD280值應在1.7～2.0之間，或質量能復合檢測要求。2DB12/T838—2018用22對核心引物進行PCR反應，擴增雙親及送檢樣品各10份DNA，篩選帶型清晰，雙親間差異大，互補性好的引物作為純度鑒定的SSR分子標記。6.4PCR擴增6.4.1反應體系總體積10μL，包括5μL超純水、1μL含Mg的10×PCR緩沖液、0.8μLdNTPs（2.5mmol/L）、2+0.6μLSSR引物（10μmol/L）、1μLTaqDNA聚合酶（2.5U/μL）、1μLDNA（30～50ng/μL），混勻。6.4.2反應程序94℃預變性4min；94℃變性45s，按附錄B推薦的引物退火溫度退火45s，72℃延伸45s，循環35次；72℃延伸10min；-20℃保存備用。6.5變性聚丙烯酰氨凝膠電泳按照附錄C規定的方法，進行4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳檢測擴增產物。7純度計算以篩選出來的SSR分子標記為引物擴增送檢樣品的DNA，通過帶型統計，用具有本品種特異帶型的種子粒數占檢測樣品種子粒數的百分率表示純度，計算公式如下：3DB12/T838—2018AA附錄A（規范性附錄）溶液配制A.1DNA提取液含有200mmol/LTris-HCl（pH8.0），250mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA，0.5%SDS，經高壓蒸汽滅菌后使用。A.2引物稀釋按照引物合成單的說明先配制100μmol/L的儲存液，取適量儲存液稀釋40倍，配制濃度為2.5mmol/L的使用液。A.36×變性上樣緩沖液去離子甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1mL，溴酚藍0.125g，二甲苯青0.125g。A.410×電泳緩沖液Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液37mL，定容至1000mL。1mL剝離硅烷，49mL三氯甲烷。0.1g過硫酸銨溶于1mL超純水中?，F用現配。4DB12/T838—2018A.10A.11A.12固定液200mL冰醋酸，定容至2000mL。染色液4g硝酸銀，定容至2000mL。顯影液2000mL蒸餾水中加入40g氫氧化鈉和10mL甲醛。5DB12/T838—2018BB附錄B（規范性附錄）22對核心引物22對核心引物見表B.1。表B.122對核心引物表序號引物引物序列（5’—3’）退火溫度℃擴增片段大小范圍（bp）F:AGCCATGGCAGAATTGGAAGR:TTCAGCAGGTTCTGGTTCTGGTF:CGCATCTACATCAAGAATCAACCAR:GATGTAGAACAAGGAAGCAGGGF:GAUGAATTTTGGAGCCACACACR:AGGTGAAATGGGCAGTGGTAGAF:CAAAACCAAATAGGTCCCCCR:CGCGCAATAATTCAATATCGF:TGCGAGTACCGAGTTCTTTCTAGR:GGCAGTCCTGGGACAACTCGF:ATGTCGCTCGCAATTTCACTR:CGTAGGGAGGAGCGATAGAGF:CGGCCAAATTATTTTTCCCAGTR:TTCCCATAGTTGAAGAUCCTGCF:TACGGTTCCTCATCCCAGAAGAR:AGGATGACCAATGTTTTGCCTCF:CCCTTCCCTTTTCTCCCTTCTTR:CAGAAACAGCCATTGATGATGF:GCGGCCTTTTGATTCATACAATR:CGTTTTACTGCCCTATCTGCTTGF:GCACGAGUCAACAAAAGAGAATR:CGCTGAUCGAGACAGAGAGAGF:TCCCATTTCGCAAGAAAGAAAAR:TCCGATACAGCTGCAGTAGAAAAF,TCAGCGATTAAGAATGCGATTGR:CCAAATTGCCCTCTCTCTTCCTF:TGTAATTAATTGAGGTGCGCUAR:TCTCTGGTTGACAATTAGGCCCF:TCCAAACTACAAGCCTGCCTAACCR:TTTTGCATTATTGAGTCCCACAGCF:CCACAAAGGGTTTAAGCAGCR:AAGGCAGGAGCAGAGTTCAAF:AATGCGGAGGAAGAAGAGGAAGR:TAGTCCTTATCACCGACACGGC12LJ-1LJ-25454526058605453545653545253656054555654545897~121150~15485~1173LJ-34LJ-4274~34281~1015LJ-56LJ-6106~118136~145138~151142~157155~165118~121119~135116~12284~1027LJ-7142~160126~14373~94F:ACGAGGTCCACTTCCCCATTATR:TTAGAGAAGGAATAACCGGCAGCF:CGCGATTCGATTGCTAAATCTCR:CTAATTTCCCAGTTGCGTCTGCF:TTCGGCTATTTGAACAGAAGCAR:TGATCCCTTCTTGTTTGATTTTTGF:TTTTGGGGTTCAATAAAGCTGTGR:TTCAACAAGATCATCAATTCACCA106~124237~255140~168150~150289~3186DB12/T838—2018CC附錄C（規范性附錄）制膠過程C.1凝膠制作將玻璃板洗凈，用無水乙醇擦兩遍，晾干。在長板上涂1%親和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作過程中防止兩塊玻璃板互相污染。待玻璃板徹底干燥后，將其組裝好，用水平儀調平。取4.5%丙烯酰胺膠80mL，加入TEMED80μL和10%過硫酸銨400μL，迅速混勻后灌膠。灌膠過程中防止氣泡產生。灌膠結束后，將梳子齒向外，輕輕的插入膠中，使其聚合1h以上。C.2預電泳待膠凝固后，拔出梳子，將電泳槽組裝好，80W恒功率下預電泳15min～20min。C.3變性在20μLPCR產物中加入4μL6×變性上樣緩沖液，混勻后