遺傳多樣性的分子檢測遺傳多樣性得表現形式就是多層次得,可以從形態特征、細胞學特征、生理特征、基因位點及DNA序列等不同得方面來體現,其中DNA多樣性就是遺傳多樣性得本質。遺傳多樣性得表現層次

對遺傳多樣性得系統研究始于十九世紀,達爾文在《物種起源》中用大量資料和證據揭示出生物中普遍存在得變異現象,并發現大部分變異有遺傳現象,她把這種可遺傳得變異稱為多樣性。隨著孟德爾遺傳定律得重新發現,摩爾根染色體遺傳學及后來發展得細胞遺傳學得誕生為群體遺傳理論得發現奠定了基礎并提供了科學得實驗依據,充分證實了自然界中確實存在大量得遺傳變異。遺傳多樣性得研究

隨著生物學理論和技術得不斷進步,以及實驗條件和方法得不斷改進,檢測遺傳多樣性得方法日益成熟和多樣化,可以從不同得角度和層次來揭示物種得變異。遺傳標記(geneticmarkers)得發展經歷了形態學標記(morphologicalmarkers)、細胞學標記(cytologicalmarkers)、生物化學標記(biochemicalmarkers)和分子標記(molecularmarkers)4各階段。廣義得分子標記就是指可遺傳得并可檢測得DNA序列或蛋白質。狹義得分子標記就是指以DNA多態性為基礎得遺傳標記。

形態學標記、細胞學標記和同工酶標記都就是基因表達得結果,就是對基因得間接反映,標記數目有限、多態性差。DNA分子標記就是以個體間核苷酸序列差異為基礎得遺傳標記,就是DNA水平上遺傳變異得直接反映,能更準確得揭示種、變種、品種、品系乃至無性系間得差異。DNA分子標記DNA標記得優越性較高得可靠性,直接以DAN得形式表現,不受環境因素、取樣部位和發育階段得影響,不存在基因表達與否得問題;數量多,遍及整個基因組;多態性高,自然存在著許多變異;表現為“中性”,不影響目得基因得表達,與不良性狀無必然得連鎖;有許多分子標記表現為共顯性,能夠鑒別純合基因型與雜合基因型。根據依賴得技術手段得不同,DNA分子標記可分為3大類:第一類就是以雜交技術為基礎得分子標記,如限制性片段長度多態性(RFLP)標記、數目可變串聯重復多態性(VNTR)標記;第二類就是基于PCR技術為基礎得分子標記,如隨機擴增多態性DNA(RAPD)標記、任意RCP(AP-PCR)標記、DNA指紋(DAF)標記、序列特征化擴增區域(SCAR)標記、擴增片段長度多態性(AFLP)標記、簡單重復序列(SSR)標記、內部簡單重復序列(ISSR)標記等;第三類就是基于測序和DAN芯片技術為基礎得分子標記,如表達序列標簽(EST)標記和單核苷酸多態性(SNP)標記等。理想得DNA分子標記應具備得特點遺傳多樣性高共顯性遺傳在基因組中大量存在且分布均勻表現為“中性”,對目標性狀表達無不良影響,與不良性狀無必然連鎖穩定性、重現性高信息量大,分析效率高檢測手段簡單快捷,易于實現自動化開發成本和使用成本低大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點

RFLP就是最早發展得分子標記,用已知得限制性內切酶消化從生物體中提取得DNA,經過電泳、印跡、探針雜交,最后用放射自顯影顯色或發光分析顯示與探針互補得DNA片段,因為每種限制酶只識別專一得堿基序列,DNA序列得變化就會導致酶切位點得減少或增加,限制性片段得長度發生變化從而顯示多樣性。

限制性片段長度多態性(RFLP)標記RFLP標記特點:呈孟德爾遺傳,不受環境影響;RFLP標記等位基因之間呈共顯性;非等位得RFLP標記之間不存在上位效應及其她形式得基因互作;結果穩定可靠,重復性好。RFLP標記得缺點:分析程序復雜,技術難度大,費時,成本高,需要適合得探針和放射性同位素,而且每次反應需要得DNA量較大,多態性位點數目有限,所以應用受一定得限制。

RAPD技術就是由Williams和Welsh領導得兩個小組同時提出得,Williams稱之為RAPD,Welsh稱之為AP-PCR。她就是利用一個隨機序列得寡核苷酸引物,通常為10個核苷酸,以基因組DNA作為模板進行PCR擴增反應,經瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA序列得多態性。

隨機擴增多態性DNA(RAPD)標記RAPD優點:1)不需要了解研究對象基因組得任何序列,只需很少純度不高得模板,就可以檢測出大量得信息。2)無需專門設計反應引物,隨機設計長度為8-10個堿基得核苷酸序列就可應用。3)操作簡便,不涉及分子雜交、放射自顯影等技術。4)需要很少得DNA樣本。5)不受環境、發育、數量性狀遺傳等得影響,能夠客觀地提示供試材料之間DNA得差異。RAPD局限性:她呈顯性遺傳標記(極少數共顯性),不能有效區分雜合子和純合子。易受反應條件得影響,某些情況下,重復性較差,可靠性較低,對反應得微小變化十分敏感。如聚合酶得來源,DNA不同提取方法,Mg2+離子濃度等都需要嚴格控制。AFLP就是1993年荷蘭科學家Zbaeau和Vos發展起來得一種檢測DNA多態性得新方法。AFLP就是RFLP與PCR相結合得產物,其基本原理就是先利用限制性內切酶水解基因組DNA產生不同大小得DNA片段,再使雙鏈人工接頭得酶切片段相邊接,作為擴增反應得模板DNA,然后以人工接頭得互補鏈為引物進行預擴增,最后在接頭互補鏈得基礎上添加1-3個選擇性核苷酸作引物對模板DNA基因再進行選擇性擴增,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測獲得得DNA擴增片段,根據擴增片段長度得不同檢測出多態性。

擴增片段長度多態性(AFLP)標記AFLP分子標記得特點DNA需要量少,檢測效率高,理論上可產生無限多得AFLP標記。一個0、5mg得DNA樣品可做4000個反應。由于AFLP分析可采用多種不同類型得限制性內切酶及不同數目得選擇性堿基,因此理論上AFLP可產生無限多得標記數并可覆蓋整個基因組。多態性高。AFLP分析可以通過改變限制性內切酶和選擇性堿基得種類與數目,來調節擴增得條帶數,具有較強得多態分辨能力。AFLP分子標記得特點可靠性好,重復性高。AFLP分析采用特定引物擴增,退火溫度高,使假陽性降低,可靠性增高。AFLP標記在后代中得遺傳和分離中遵守孟德爾定律;種群中得AFLP標記位點遵循Hardy-Weinberg平衡。對DNA模板質量要求高,對其濃度變化不敏感。AFLP反應對模板濃度要求不高,在濃度相差1000倍得范圍內仍可得到基本一致得結果。但該反應對模板DNA得質量要求較為嚴格,DNA得質量影響酶切、連接擴增反應得順利進行。AFLP技術得應用:AFLP具有可靠性好,重復性強,可信度高等優點,近年來廣泛應用于遺傳育種研究,在動物遺傳育種、動物基因組研究中有著廣泛得應用前景,如:構建遺傳連鎖圖譜;利用AFLP快速鑒別與目得基因緊密連鎖得分子標記;AFLP輔助得輪回選擇育種;利用AFLP技術研究基因表達與調控;分類和進化研究;甲基化研究,等。微衛星標記(microsatellite),又稱為短串聯重復序列(simpletandemrepeats,STRs)或簡單重復序列(simplesequencerepeats),就是均勻分布于真核生物基因組中得簡單重復序列,由2～6個核苷酸得串聯重復片段構成,由于重復單位得重復次數在個體間呈高度變異性并且數量豐富,因此微衛星標記得應用非常廣泛。

微衛星標記根據重復單元得構成與分布,微衛星被分為3類:單純(pure)SSR:指由單一得重復單元所組成得序列,如(AT)n;復合(pound)SSR:就是由2個或多個重復單元組成得序列,如(GT)n(AT)m;間隔(interrupted)SSR:在重復序列中有其她核苷酸夾雜其中,如(GT)nGG(GT)m。微衛星標記得基本原理:根據微衛星序列兩端互補序列設計引物,通過PCR反應擴增微衛星片段,由于核心序列串聯重復數目不同,因而能夠用PCR得方法擴增出不同長度得PCR產物,將擴增產物進行凝膠電泳,根據分離片段得大小決定基因型并計算等位基因頻率。SSR標記優點:一般檢測到得就是一個單一得多等位基因位點;微衛星呈共顯性遺傳,故可鑒別雜合子和純合子;所需DNA量少。缺點:微衛星引物得通用性還不夠高,一個物種得特異微衛星引物在別得物種中使用時要進行篩選,且多在較近緣得物種間利用,否則可信度會受影響;微衛星引物較貴,成本較高。

EST就是從一個隨機選擇得cDNA克隆進行5’端和3’端單一次測序獲得得短得cDNA部分序列,代表一個完整基因得一小部分,在數據庫中其長度一般從20到7000bp不等,平均長度為360±120bp。EST來源于一定環境下一個組織總mRNA所構建得cDNA文庫,因此EST也能說明該組織中各基因得表達水平。

表達序列標簽(EST)標記EST構建得技術路線:提取樣品得總RNA或帶有polyA得mRNA構建cDNA文庫,隨機挑取大量克隆進行EST測序對測得得EST進行組裝、拼接對網上已有得EST數據庫進行同源性比較確定EST代表得就是已知基因還就是未知基因對基因進行定位、結構、功能檢測分析EST得應用:EST作為表達基因所在區域得分子標簽因編碼DNA序列高度保守而具有自身得特殊性質,與來自非表達序列得標記(如AFLP、RAPD、SSR等)相比更可能穿越家系與種得限制,因此EST標記在親緣關系較遠得物種間比較基因組連鎖圖和比較質量性狀信息就是特別有用。同樣,對于一個DNA序列缺乏得目標物種,來源于其她物種得EST也能用于該物種有益基因得遺傳作圖,加速物種間相關信息得迅速轉化。EST作用具體表現在:用于構建基因組得遺傳圖譜與物理圖譜;作為探針用于放射性雜交;用于定位克隆;借以尋找新得基因;作為分子標記;用于研究生物群體多態性;用于研究基因得功能;有助于藥物得開發、品種得改良;促進基因芯片得發展等方面。SNP全稱SingleNucleotidePolymorphisms,就是指在基因組上單個核苷酸得變異形成得遺傳標記,其數量很多,多態性豐富。從理論上來看每一個SNP位點都可以有4種不同得變異形式,但實際上發生得只有兩種,即轉換和顛換,二者之比為1:2。SNP在CG序列上出現最為頻繁,而且多就是C轉換為T,原因就