本科生分子生物學揭示生命奧秘的分子基礎探索核酸和蛋白質的結構與功能課程目標和學習要求掌握核心概念理解分子生物學基本理論和原理實驗技能培養熟悉主要實驗技術和操作方法分析能力提升培養科學思維和問題解決能力應用能力發展分子生物學的發展歷史1早期探索階段1869年：米歇爾發現DNA2基礎奠定階段1953年：沃森和克里克提出DNA雙螺旋結構3分子機制階段1961年：遺傳密碼破譯開始4技術革命階段1975年：DNA測序和重組DNA技術興起5基因組學時代2003年：人類基因組計劃完成核酸的化學組成五碳糖DNA含2-脫氧核糖RNA含核糖含氮堿基嘌呤：A和G嘧啶：C、T(DNA)和U(RNA)磷酸基團連接核苷酸形成骨架提供負電荷核苷酸堿基+糖+磷酸核酸的基本單位DNA的結構雙螺旋結構兩條多核苷酸鏈圍繞同一軸盤旋堿基配對A-T配對（雙氫鍵）G-C配對（三氫鍵）反向平行排列兩鏈方向相反：5'→3'和3'→5'結構參數每轉34?，含10個堿基對RNA的結構和類型mRNA信使RNA，攜帶遺傳信息提供蛋白質合成的模板tRNA轉運RNA，運送氨基酸具有獨特的三葉草結構rRNA核糖體RNA，構成核糖體參與蛋白質合成其他RNAmiRNA、siRNA、lncRNA等參與基因表達調控核酸的理化特性紫外吸收特性最大吸收波長260nm變性后吸光度增加（增色效應）熱變性特性高溫導致雙鏈分離Tm值與GC含量正相關復性特性溫度降低可重新形成雙鏈是核酸雜交技術的基礎蛋白質的結構與功能酶催化功能催化生化反應防御功能抗體參與免疫防御運輸功能血紅蛋白運輸氧氣結構功能膠原蛋白提供結構支持信號傳導激素和受體介導信號傳遞氨基酸的結構與性質氨基酸基本結構：α-碳原子連接氨基、羧基和R基團按R基團分類：非極性、極性不帶電、帶正電、帶負電肽鍵的形成與蛋白質一級結構氨基酸游離狀態的氨基酸分子縮合反應羧基與氨基縮合失水肽鍵形成C-N共價鍵連接氨基酸一級結構氨基酸線性排列順序蛋白質的二級結構α螺旋骨架原子排列成右手螺旋每圈3.6個氨基酸殘基相隔4個殘基的NH和CO形成氫鍵β折疊肽鏈呈鋸齒狀排列相鄰肽鏈間形成氫鍵分為平行和反平行兩種無規則卷曲不規則排列區域常在蛋白質表面具有較高柔性蛋白質的三級結構和四級結構三級結構整個多肽鏈的三維折疊構象由多種化學鍵和作用力穩定：疏水作用氫鍵鹽橋二硫鍵四級結構多個亞基的空間排列組合亞基間相互作用形式：非共價鍵相互作用同源或異源多聚體對稱或非對稱排列結構穩定性影響因素包括：溫度pH值離子強度變性劑DNA復制的基本概念復制起始DNA解旋，形成復制起始點鏈延伸DNA聚合酶合成新鏈校對修復檢查并糾正錯誤配對復制終止完成DNA分子復制原核生物DNA復制1復制起點單一環狀染色體上只有一個oriC2復制方向雙向復制，形成兩個復制叉3復制速度約1000個核苷酸/秒30完成時間約30-40分鐘完成整個基因組復制真核生物DNA復制多起點復制每條染色體上有多個復制起點特定時間復制S期完成DNA復制復制單位復制子是獨立復制的DNA片段端粒復制需要特殊的端粒酶DNA復制的酶系統拓撲異構酶解除DNA超螺旋解旋酶解開DNA雙鏈單鏈結合蛋白穩定單鏈DNA引物酶合成RNA引物DNA聚合酶合成新DNA鏈連接酶連接DNA片段DNA復制的起始識別起點起始蛋白識別特定DNA序列DNA解旋解旋酶打開雙螺旋引物合成引物酶合成短RNA引物復制起始DNA聚合酶開始鏈延伸DNA復制的延伸領先鏈：連續合成，5'→3'方向滯后鏈：不連續合成，形成岡崎片段DNA聚合酶僅能從3'端添加核苷酸DNA復制的終止復制叉會合兩個復制叉相遇DNA解旋停止解旋酶活性終止連接末端連接酶連接DNA末端分子分離兩個完整DNA分子分開DNA修復機制堿基切除修復識別并切除錯誤堿基修復小型DNA損傷核苷酸切除修復切除含損傷的DNA片段修復紫外線損傷錯配修復識別并修復堿基錯配提高復制準確性雙鏈斷裂修復連接斷裂的DNA雙鏈修復放射線損傷轉錄的基本概念轉錄起始RNA聚合酶結合啟動子鏈延伸按DNA模板合成RNA轉錄終止RNA聚合酶脫離模板RNA加工轉錄產物進行修飾RNA聚合酶的結構和功能原核生物RNA聚合酶核心酶(α2ββ')加σ因子RNA聚合酶I轉錄rRNA前體RNA聚合酶II轉錄mRNA和大多數snRNARNA聚合酶III轉錄tRNA和5SrRNA原核生物的轉錄過程啟動子識別σ因子識別-10和-35區DNA解鏈形成轉錄泡核苷酸添加5'→3'方向延伸RNA鏈終止信號Rho依賴或非依賴終止真核生物的轉錄過程轉錄前起始組裝前起始復合物招募基本轉錄因子形成閉合復合物轉錄起始形成開放復合物合成短鏈RNA脫離啟動子區域轉錄延伸RNA聚合酶II活性增強延伸因子參與同時進行RNA加工轉錄終止識別多聚A信號終止因子結合RNA和DNA模板分離轉錄后加工：RNA剪接識別剪接位點5'和3'剪接位點序列特異性剪接體組裝snRNP和蛋白質形成剪接體內含子切除兩步轉酯反應切除內含子外顯子連接相鄰外顯子連接形成成熟RNA轉錄后加工：RNA修飾5'帽子結構加入7-甲基鳥苷酸帽RNA甲基化特定位點甲基化修飾RNA編輯堿基插入、刪除或替換3'聚A尾添加多聚腺苷酸尾巴遺傳密碼及其特點三聯體：每三個核苷酸編碼一個氨基酸簡并性：多個密碼子可編碼同一氨基酸無重疊：密碼子之間無重疊通用性：大多數生物共用相同密碼翻譯的基本概念密碼解讀將核酸語言轉換為蛋白質語言參與分子mRNA、tRNA、核糖體和輔助因子基本過程起始、延伸、終止三個階段能量需求需要GTP水解提供能量tRNA和氨基酰-tRNA合成酶tRNA結構三葉草二級結構L形三級結構功能區域反密碼子：識別mRNA密碼子接受臂：連接氨基酸合成酶特異性每種氨基酸對應特定合成酶高度識別特異性反應過程兩步反應消耗ATP能量核糖體的結構和功能原核生物核糖體70S核糖體30S小亞基：16SrRNA和21種蛋白50S大亞基：23S和5SrRNA及34種蛋白真核生物核糖體80S核糖體40S小亞基：18SrRNA和33種蛋白60S大亞基：28S、5.8S和5SrRNA及49種蛋白功能位點A位：接受位點P位：肽基位點E位：退出位點PTC：肽基轉移中心翻譯的起始起始復合物形成原核生物：30S亞基結合mRNA和起始tRNAIF1、IF2和IF3參與識別SD序列和AUG密碼子起始復合物形成真核生物：43S前起始復合物形成結合mRNA形成48S復合物掃描機制尋找AUG密碼子多種eIF因子參與完整核糖體組裝大亞基結合，形成完整核糖體起始因子釋放準備進入延伸階段翻譯的延伸氨基酰-tRNA結合EF-Tu/eEF1A攜帶tRNA進入A位肽鍵形成P位多肽鏈轉移至A位氨基酸移位EF-G/eEF2促進核糖體移位循環A位空出準備接受下一個tRNA翻譯的終止1終止密碼子UAA、UAG或UGA進入A位2釋放因子結合RF1/RF2(原核)或eRF1(真核)識別終止密碼子3多肽鏈釋放催化酯鍵水解，釋放新合成蛋白質4核糖體解離核糖體亞基分離，可重新參與翻譯翻譯后修飾蛋白質剪切去除信號肽或前導序列化學基團添加磷酸化、糖基化、甲基化等二硫鍵形成穩定蛋白質三維結構亞基組裝多亞基蛋白質的組裝成熟定位運輸轉運至正確細胞位置原核生物基因表達調控：操縱子模型操縱子組成啟動子：RNA聚合酶結合位點操作子：調控蛋白結合位點結構基因：編碼蛋白質負調控模式抑制物阻斷基因表達誘導物解除抑制例如：乳糖操縱子正調控模式激活蛋白激活轉錄通常響應環境信號例如：阿拉伯糖操縱子乳糖操縱子抑制狀態無乳糖環境下抑制物結合操作子RNA聚合酶無法轉錄誘導狀態乳糖存在環境下乳糖與抑制物結合抑制物構象改變無法結合操作子基因產物β-半乳糖苷酶透酶硫代半乳糖苷酰轉移酶色氨酸操縱子抑制狀態激活狀態色氨酸過多時：抑制物與色氨酸結合，抑制物活化，結合操作子，阻止轉錄色氨酸缺乏時：抑制物無活性，不能結合操作子，允許轉錄負反饋機制：產物過多時抑制自身合成真核生物基因表達調控：轉錄水平順式作用元件DNA上的調控序列：核心啟動子近端啟動子增強子沉默子應答元件反式作用因子調控蛋白質：基本轉錄因子特異性轉錄因子輔激活因子輔抑制因子染色質結構調控影響DNA可及性：染色質重塑組蛋白修飾DNA甲基化真核生物基因表達調控：轉錄后水平可變剪接一個基因產生多種mRNAmRNA穩定性調控RNA降解速率mRNA定位控制RNA轉運和亞細胞定位翻譯抑制miRNA和siRNA調控機制表觀遺傳學調控定義特點不改變DNA序列的遺傳現象可遺傳至子代細胞受環境因素影響可逆性修飾主要機制DNA甲基化組蛋白修飾非編碼RNA調控染色質重塑生物學意義基因表達精細調控細胞分化和發育基因組穩定性維持環境適應性反應DNA甲基化甲基化建立DNMT3催化從頭甲基化甲基化維持DNMT1維持DNA復制后甲基化模式甲基化去除TET酶催化主動去甲基化基因沉默啟動子甲基化抑制基因表達組蛋白修飾乙酰化：中和賴氨酸正電荷，松弛染色質，激活轉錄甲基化：可激活或抑制轉錄，取決于位點和程度磷酸化：參與染色質凝聚和DNA修復泛素化：調控蛋白穩定性和活性非編碼RNA調控miRNA21-23nt，轉錄后抑制siRNA21-25nt，靶向mRNA降解piRNA26-31nt，沉默轉座子lncRNA>200nt，多種調控功能circRNA環狀RNA，miRNA海綿基因重組的基本概念1遺傳多樣性產生新的基因組合DNA修復修復受損DNA3基因組穩定性維持染色體完整性進化動力加速物種適應和進化同源重組雙鏈斷裂DNA雙鏈斷裂形成同源序列搜索RecA/Rad51介導搜索配對鏈侵入與置換形成D-loop結構Holliday結構形成形成十字結構中間體解析與連接切割解析重組產物位點特異性重組1特異位點識別重組酶識別特定DNA序列2DNA斷裂切割特定識別位點DNA交換DNA片段交換位置4DNA連接DNA末端重新連接轉座子和基因重排DNA轉座子"剪切-粘貼"機制完全離開原位置例如：Tn5，Tn10RNA轉座子"復制-粘貼"機制通過RNA中間體例如：反轉錄轉座子生物學意義基因組多樣性基因表達調控染色體結構改變基因工程的基本原理目的基因獲取PCR擴增或合成DNA酶切限制性內切酶切割DNA連接連接酶催化連接轉化宿主重組DNA導入宿主細胞篩選鑒定鑒定目的克隆限制性內切酶和DNA連接酶限制性內切酶特點：識別特定DNA序列在特定位點切割產生平端或粘性末端分類：I型：復雜、隨機切割II型：簡單、特定位點切割III型：需ATP，切割識別序列附近DNA連接酶功能：催化DNA片段連接形成磷酸二酯鍵修復DNA斷裂種類：T4DNA連接酶：需ATPE.coliDNA連接酶：需NAD+克隆載體系統3質粒載體復制起點抗性標記多克隆位點噬菌體載體容量較大高效包裝λ或M13噬菌體人工染色體BAC、YAC、PAC可容納大片段穩定傳遞穿梭載體多宿主復制多種選擇標記便于表達檢測PCR技術原理及應用變性95℃使DNA雙鏈分離退火50-65℃引物與模板結合延伸72℃DNA聚合酶合成互補鏈循環30-40次循環指數擴增目標序列基因表達系統原核表達系統：高效但無翻譯后修飾真核表達系統：翻譯后修飾完善但成本高誘導性表達：通過誘導劑控制表達水平基因組學概述結構基因組學DNA序列測定和分析功能基因組學基因功能和表達研究比較基因組學不同物種基因組比較計算基因組學基因組數據計算分析轉錄組學和蛋白質組學轉錄組學研究對象：全部RNA轉錄物轉錄水平基因表達主要技術：RNA-Seq芯片雜交單細胞測序蛋白質組學研究對象：全部蛋白質產物蛋白質表達與修飾主要技術：質譜分析蛋白質芯片蛋白質互作組生物信息學基礎序列分析：比對、搜索和進化分析結構預測：蛋白質和RNA二級、三級結構功能注釋：預測基因和蛋白質功能系統生物學：整合多組學數據分析CRISPR/Cas9基因編輯技術CRISPR/Cas9系統組成Cas9核酸酶sgRNA引導分子工作原理sgRNA識別目標序列Cas9切割DNA雙鏈細胞修復機制修復斷裂編輯方式非同源末端連接：基因敲除同源定向修復：精確編輯堿基編輯：單堿基修改分子生物學在醫學中的應用分子診斷核酸檢測技術診斷疾病基因治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