第三節其他載體2012.092.3基因工程載體-人工染色體載體其他載體一、人工染色體二、植物基因工程載體三、動物基因工程載體2.3基因工程載體-人工染色體載體一、人工染色體2.3基因工程載體-人工染色體載體

人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和篩選人的基因組文庫，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）載體應運而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(centromere)及復制起點等功能序列，可插入長度達200-500kb的外源DNA，導入酵母細胞可以隨細胞分裂周期復制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計劃的重要2.3基因工程載體-人工染色體載體1、酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC)2.3基因工程載體-人工染色體載體酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）◆酵母人工染色體是另一類酵母穿梭載體。具有自主復制序列、克隆位點以及可在細菌和酵母菌中選擇的標記基因。◆

YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，這一特點使YAC成為人類基因組計劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進了發展人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。2.3基因工程載體-人工染色體載體正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel)*酵母自主復制序列（ARS)*酵母著絲點(CEN)*酵母的選擇標記(TRP1、URA1)YAC載體2.3基因工程載體-人工染色體載體

thecapacitytoclonelargeexogenousDNAfragments(upto2Mb)hasmadeYACsavitaltoolinphysicalmapping

Thefunctionalelementsofayeastchromosome

2.3基因工程載體-人工染色體載體（1）著絲粒區（CEN）A

AGTCACGTG

TTGTTTCTGNTTTCCGAAAYAC的組成結構酵母染色體著絲粒區的保守序列:78-86bpIIIIII由三個區組成2.3基因工程載體-人工染色體載體酵母端粒保守序列是(G4T2)n

重復序列。（3）復制起點（ORI）約100bp的自主復制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）（真核生物中只有酵母菌有ARS）兩個端粒序列Tel。2.3基因工程載體-人工染色體載體位于SUP4

基因內部。（4）克隆位點插入失活選擇：SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色；不失活的菌落是白色。142.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體2、細菌人工染色體（Bacterialartificialchromosome,BAC）2.3基因工程載體-人工染色體載體細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）

◆

BAC載體是基于細菌的性因子(F因子)質粒的一些特點構建的。F因子在細菌接合時轉移1Mb的細菌染色體片段。將F因子經基因工程改良構成的BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。◆帶有外源片段的BAC載體在細菌細胞中通常僅單個拷貝，這一特點有利于保持DNA大分子，在細胞內穩定復制而不發生重組。BAC載體本身分子量小，具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點。2.3基因工程載體-人工染色體載體Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.2.3基因工程載體-人工染色體載體3、PAC載體2.3基因工程載體-人工染色體載體二、植物載體2.3基因工程載體-人工染色體載體PlantcloningvectorsTi質粒:侵染廣泛的雙子葉植物T-DNA或T-區(T-region)：約20kb，包含專化冠癭堿生化合成和冠癭瘤生長的基因，隨機地整合到植物染色體上。結構特點：兩端具有25個堿基對的順向重復序列，但重復不是完全的。25個堿基對的序列稱為T-DNA的邊界序列(T-DNAbordersequence)。去除右邊界序列，將使T-DNA失去轉移和整合的功能；左邊界的缺失，對致瘤性無明顯影響。毒性區域即vir(virulence)區域:引起T-DNA轉移的區域。長度約35kb，和T-DNA處于不同位置2.3基因工程載體-人工染色體載體植物Ti質粒載體2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體（1）T-DNA區（transferred-DNAregions）

T-DNA是農桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上導入植物細胞的一段DNA。

T-DNA兩端各有一段25bp的重復序列(LB,RB)。T-DNA攜帶的致瘤基因是一些與激素合成有關的基因，由于激素合成基因使細胞處于不停的分裂狀態，形成冠癭瘤，不能進行細胞分化。Ti質粒改造后才能應用于植物的基因工程。保留T-DNA兩端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使轉化的植物細胞不具有成瘤能力。2.3基因工程載體-人工染色體載體T-DNA區域內的所有基因與轉移無關，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將細菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到這個區域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內的序列轉移并整合到植物基因組。Vir區的毒性基因是T-DNA轉移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉移。2.3基因工程載體-人工染色體載體（2）Vir區（virolenceregion）Vir區段上的基因與T-DNA從細菌轉移到植物細胞的遺傳過程有關，區段上的基因能夠使農桿菌表現出毒性，故稱之為毒性區。Vir區段總長度大約35kb，由7個互補群組成，分別命名為VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。（3）Con區(regionsencodingconjugations)

該區段上存在著與細菌間接合轉移的有關基因（tra），調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移。

（4）Ori區(originofreplication)

該區段基因調控Ti質粒的自我復制，故稱之為復制起始區。2.3基因工程載體-人工染色體載體Ti質粒分子受到信號分子的激活作用之后，virD基因編碼的一種核酸內切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4堿基之間切開一個單鏈缺口，隨后在T-DNA同一條鏈的LB序列中切出第二個單鏈缺口。T-DNA便以單鏈形式釋放出來，并在RB序列的引導下定向地轉移到寄主植物細胞。在有關的植物細胞酶體系的催化作用下，合成互補鏈形成雙鏈形式的T-DNA分子。在一系列酶的參與下整合進植物基因組。這種整合是一種非正常重組。T-DNA轉移的機制2.3基因工程載體-人工染色體載體2、Ti質粒載體DisarmedTivectors（非致瘤載體）Cointegratevectors（共整合載體）Binaryvectors（雙元載體）2.3基因工程載體-人工染色體載體1）DisarmedTivectors去除T-DNA中的腫瘤基因在T-DNA中插入用于轉化植株篩選的遺傳標記基因2.3基因工程載體-人工染色體載體IntermediatevectorsAsmallportionofT-DNAwassubclonedinaconventionalE.coliplasmidvector(i.e.pBR322)foreasymanipulation,producingintermediatevectorsIntermediatevectorsareincapableofreplicationinA.tumefaciensandalsolackconjugationfunctions.Transferofthemwasachievedusingatriparentalmating.2.3基因工程載體-人工染色體載體TriparentalmatingAnE.colistrainAcarryingahelperplasmidabletomobilizetheintermediatevectorintransTheE.colistrainBcarryingtherecombinantintermediatevectorA.tumefacienscarryingthedisarmedTiplasmid2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體3.BinaryvectorT-DNAdoesnotneedtobephysicallyattachedtotherestoftheTiplasmidUseseparateplasmidstosupplythedisarmedT-DNAandthevirulencefunctions2.3基因工程載體-人工染色體載體ThesmallplasmidcanbeusedtoinsertedforeigngeneWhenthetwoplasmidspresenttogetherinthesameA.tumefacienscell,theT-DNAcarriedbypBI121istransferredtotheplantchromosomalDNAbyproteinscodedbygenescarriedbypAL44042.3基因工程載體-人工染色體載體Ti質粒及其衍生載體Ti質粒是約200-500kb的環狀DNA分子，很難直接使用，故需對其加以改造，構建出Ti質粒的衍生載體系統，廣泛用作植物基因工程中的載體：（1）雙元載體(binaryvectors）如pBin19載體，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作為細菌選擇標記，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作為植物的選擇標記，pUC19的多克隆位點及α-互補顯色標記（2）共整合載體(integratedvectors)2.3基因工程載體-人工染色體載體（1）雙元載體系統（binaryvector）具有兩個質粒——穿梭質粒和Ti質粒。（2）共整合載體（integratedvector）共整合載體系統包括在T-DNA上的激素合成區經過突變后的Ti質粒和中間載體兩部分。Ti質粒的衍生載體2.3基因工程載體-人工染色體載體發根農桿菌存在另一種質粒，Ri質粒。Ri質粒也可完成外源基因向植物的轉移工作。發根農桿菌侵染后植物細胞產生許多不定根，這種不定根生長迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根，也稱為發狀根，分別簡稱為毛根或發根，Ri質粒為根誘導質粒。Ri質粒的結構與Ti質粒的結構很相似，可以分為T區、vir區、ori區和其它區域等幾個部分。Ri質粒2.3基因工程載體-人工染色體載體T區與Ti質粒的T-DNA十分相似：①T區的左右邊界序列。左右邊界上含有25bp的重復序列。②TL-DNA區。該區中含有與毛狀根形成有關的rolA、B、C、D基因群。③TR-DNA區。該區中含有與農桿堿合成有關的基因（ags）和生長素合成有關的基因（tms1、

tms2）。ags基因在轉化的初期起著重要的作用，是不定根產生的關鍵Ri質粒2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體CaMV克隆載體含1個約8kb的環狀雙鏈DNA分子；用于十字花科和少數非十字花科的植物基因轉移；其感染對植物有害，不能直接做載體；CaMV的DNA在植物細胞中能高水平轉錄35SRNA，其啟動子是一強啟動子。構建的含35S啟動子的系列克隆載體可在植物細胞內高效表達基因。2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體三、動物載體2.3基因工程載體-人工染色體載體

質粒和噬菌體載體只能在細菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。由于動物細胞的培養和操作較復雜、花費也較多，因而病毒載體構建時一般都把細菌質粒復制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（SimianVirus40）、逆轉錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動物細胞中表達或試驗其功能、或作基因治療等。

2.3基因工程載體-人工染色體載體

猴病毒40（SV40）的基因組常用來作為克隆載體，把外源DNA轉入哺乳類細胞。猴病毒40是球形動物病毒，直徑40nm，呈20面體，有一個共價閉環的雙鏈DNA基因組，全長5244bp。它在猴腎中增殖。被SV40感染的細胞都會出現SV40的T抗原。早已證明完整的小鼠染色體β珠蛋白基因（包括所有的間插順序和兩側順序）整合在SV40中后，在被感染的猴腎細胞中都能正確地轉錄和翻譯。表明猴腎細胞的拼接系統能有效地處理小鼠β珠蛋白的初級轉錄本。2.3基因工程載體-人工染色體載體Cloningvectorsofanimalcell動物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物

5243bp共價閉合環狀分子感染率高，幾乎100％寄主細胞能被感染能提供完整的真核基因轉錄所需的成分侵染性具有寄主特異性改建：野生型最多只能包裝其基因組長度的1.05倍的

DNA分子其他：痘苗病毒DNA作載體，表達乙肝表面抗原用家蠶的核多角體病毒表達人α-干擾素2.3基因工程載體-人工染色體載體SV40作為克隆載體有其局限性：①SV40基因組的晚期功能區的裂解性，不利于外源DNA的重組和表達；②早期功能區與病毒的致癌性有關，使用時有顧慮；③重組DNA片段的大小受體限制。2.3基因工程載體-人工染色體載體

逆轉錄病毒是RNA病毒，它有三個基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白。有的逆轉錄病毒還帶有癌基因（vonc），即有的逆轉錄病毒有致癌作用。近年來，已設計構建成一些缺陷型病毒（defectivevirus）使逆轉錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉入了人體造血前體細胞，并在細胞中表達。2.3基因工程載體-人工染色體載體反轉錄病毒克隆載體反轉錄病毒是一類含RNA的病毒，進入受體細胞后，RNA反轉錄成DNA，通過兩端由數百bp組成的長末端重復序列，整合到染色體上，成為原病毒。只要將外源目的基因組入原病毒DNA的合適克隆位點，就能在感染的動物細胞中表達。2.3基因工程載體-人工染色體載體Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉錄病毒，因此不能合成自身的外殼，但它有識別外殼蛋白進行包裝的信號（一段尚未鑒定的DNA順序）。用這種缺陷的逆轉錄病毒去感染某種細胞株，這種細胞株包含有輔助病毒（helpervirus）。輔助病毒能合成蛋白外殼，但缺失了識別蛋白外殼進行包裝的信號，因此它不能包裝成病毒顆粒。當用逆轉錄病毒感染細胞株后，逆轉錄病毒的RNA進入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。這時把受感染的細胞同骨髓細胞一起培養，包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉錄病毒RNA，進入骨髓細胞，病毒DNA插入宿主細胞基因組，基因的活性得到表達。這時，由于骨髓細胞里面沒有輔助病毒，所以整合進宿主基因組的逆轉錄病毒，不再有外殼蛋白可供包裝，因此也就無法增殖，而只能被“陷”在宿主基因組中，通過細胞分裂而傳給下一代子細胞。2.3基因工程載體-人工染色體載體分子克隆載體的選擇選擇克隆載體的幾個重要參數（1）實驗對象（2）實驗性質（3）載體容量（4）合適克隆位點（5）載體的穩定性（6）載體DNA制備的難易（7）外源基因表達產物產量、產物特點等2.3基因工程載體-人工染色體載體實驗對象（1）供體：遺傳背景與DNA特點等，其中包括染色體DNA大小，基因大小與結構，堿基組成，目的基因的產物特點以及遺傳物質的傳遞方式等。（2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質的傳遞方式(包括人為的方法)，DNA限制修飾系統，DNA重組基因特點，基因產物修飾系統，即轉錄與翻譯后修飾系統。2.3基因工程載體-人工染色體載體實驗對象如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。如：

E.coliDH5、

E.coliDH5α、

E.coliDH5αF’

1）

三者均有限制-修飾系統和重組基因缺陷，外源DNA可存活，且不發生重組2）

DH5α和DH5αF’都具有一個可供遺傳標記lacZα檢測的遺傳背景3）

DH5αF’可供M13mp系列載體配套使用，M13病毒的感染需要F’的存在2.3基因工程載體-人工染色體載體1．當一DNA片段插入終止子探針型載體pBU10的HindⅢ克隆位點后，重組質粒仍可轉化E.coli(CmlsTcs)為CmlrTcr，為什么?可設計什么實驗證明其假設?2．當一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出現兩類菌落，蘭色菌落和白色菌落。從白色菌落中分離純化的質粒經電泳檢查，均比原載體DNA分子大；但從蘭色菌落隨機分離的質粒DNA卻有兩類，其中一類與載體大小相同，另一類卻與白色菌落中分離的質粒大小相同。如何解釋這一實驗結果?可設計何種實驗證明你的解釋是正確的?3．當把一外源DNA插入一克隆載體后，重組DNA分子轉化E.coli

細胞所獲得的重組子分子可根據其限制酶圖譜分為兩類，即這兩類轉化子中所含的重組DNA分子的限制酶圖譜不一樣，從這兩類轉化細胞中分離到的重組DNA分子可用限制酶回收插入的片段。而從這兩類轉化細胞培養液所分離到的DNA卻2.3基因工程載體-人工染色體載體不能用限制酶回收該片段。當把同類轉化細胞培養液所分離到的DNA進行復性分析時，DNA分子間不會發生復性，但把從不同類轉化細胞培養液分離到的DNA