第四章食品毒理學實訓第四章食品毒理學實訓實訓一實驗動物的飼養管理

一、預備知識：實驗動物房的環境要求

（一）實驗動物房的環境因素

實驗動物房的環境因素分為：①物理因素。②化學因素。③生物因素。④人為因素。

實驗動物環境總體上可分為三類：①普通環境。②屏障環境。③隔離環境。第四章食品毒理學實訓（二）實驗動物房的環境指標

環境條件不僅影響實驗動物的質量，而且還直接影響動物實驗的科學性、動物反應的敏感性和實驗結果的可重復性，所以必須嚴格控制實驗動物的環境條件。

封閉式動物房要求將各種影響因素控制如下：溫度20～26℃；濕度50％～70％；噪聲＜60dB。并且還應注意防止人耳聽不到的20000～50000Hz超聲波的影響；換氣8～15次/h；氣流10～25㎝/s，定時照明l0～14h/d。

實驗動物房的房間不宜過大，每間以20㎡為好。10只小鼠至少占1～1.5m3，l0只大鼠2～3m3，每只兔1m3。動物房的其他環境指標如表4-1所示。第四章食品毒理學實訓第四章食品毒理學實訓（三）實驗動物房的消毒措施

為了保障工作人員的健康和預防實驗動物疾病，動物房內應制定定期的清潔衛生和消毒制度，保持室內清潔。每天上班后，立即檢查動物的一般狀況，發現病鼠、死鼠應查明原因，及時處理并登記。消毒包括定期消毒和臨時消毒。定期消毒包括每日(1～2次)、周(大掃除1次)、月、季度等對動物房、籠具、墊料、器械以及工作人員的手、衣物進行消毒；臨時消毒是指為了撲滅、控制或預防疾病的傳播所采用的臨時措施。

動物房消毒方法可分為：①機械消毒法。這是常規使用的方法。②物理消毒法。③化學消毒法。第四章食品毒理學實訓二、操作訓練：實驗動物的飼養管理

（一）實訓目的

（二）儀器和材料

（三）操作方法

1.大、小鼠的日常飼養管理

2.兔的日常飼養管理

3.實驗動物健康的觀察和評價

（1）動物的外表與行為觀察

（2）個體檢查

（3）采食和飲水觀察第四章食品毒理學實訓（四）實訓結果

1.計算動物一晝夜之內的攝食量和飲水量。

2.對動物進行觀察檢查后，認真填寫以下記錄表，作出相應評價。第四章食品毒理學實訓實訓二實驗動物的分組、標記和染毒技術

一、預備知識：實驗動物染毒途徑

毒理學試驗中染毒途徑的選擇，應盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。最常用的染毒途徑為經口、經呼吸道、經皮及注射途徑。不同染毒途徑，毒物的吸收速率不同，一般是：靜脈注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射＞皮下注射＞經口＞皮內注射＞其他途徑(如經皮等)。第四章食品毒理學實訓（一）經口(胃腸道)染毒

經口染毒指經口攝入到達胃或用器械直接送入胃的過程。常用灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。

（二）經呼吸道染毒

氣態和易揮發的液態化學物及氣溶膠均有可經呼吸道染毒。經呼吸道染毒（inhalationexposure）常用于研究氣體、蒸汽、粉塵、煙、霧等環境污染物的毒性，這些外源化學物可由人工染毒，也可由動物自行吸入。前者是將外源化學物氣管內注入，后者有靜式吸入和動式吸入兩種染毒方法。第四章食品毒理學實訓（三）經皮膚染毒

染毒過程：脫毛→涂抹受試物→覆蓋→固定。

（1）經皮膚吸收毒性。

（2）皮膚刺激毒性。

（四）注射染毒

注射用藥品應以注射途徑染毒，對非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑，如狗可用后肢隱靜脈注射，而嚙齒類的尾靜脈和肌肉注射難以多次染毒，必要時可改為皮下注射。注射染毒，應調整受試物的pH及滲透壓，pH應5～8，最好是等滲溶液，動物對高滲的耐受力比低滲強。靜脈注射應控制速度，大鼠尾靜脈注射最好控制在10秒以上。第四章食品毒理學實訓注射染毒主要用于絕對毒性研究、比較毒性研究、毒物靜脈注射代謝動力學研究和中毒的急救藥物篩選。常根據試驗要求選擇。實驗動物不同注射途徑的注射量見表4-3。第四章食品毒理學實訓二、操作訓練：實驗動物的分組、標記和染毒技術

（一）實訓目的

（二）儀器和材料

（三）操作方法和步驟

1.健康動物的選擇和性別鑒定第四章食品毒理學實訓2.實驗動物的抓取方法第四章食品毒理學實訓第四章食品毒理學實訓第四章食品毒理學實訓3.實驗動物稱重、分組、編號、標記方法

（1）稱重。大、小鼠秤的感應量需在0.1g以下。根據實驗的不同要求，選擇一定數量的大、小鼠，體重要求在同一組內、同性別動物體重差異應小于平均體重的10％，不同組間同性別動物體重均值應小于5％。

（2）隨機數字分組法。

將實驗用30只雄性動物平均分成A，B，C，D，E，F六組，每組5只動物。將已編好號的動物依號碼用隨機數目表(見附表Ⅰ)分配。如選隨機數目表第二行，從第一個數目開始，依次抄下30個數目(依橫行、縱行、甚至斜行抄錄均可)。將各數目一律以組數除6，以余數1，2，3，4，5，0代表應分配于A，B，C，D，E，F各組的動物。結果如表4-4(從第二行隨機數表開始)。第四章食品毒理學實訓第四章食品毒理學實訓

按上法分組后，A組有動物7只，B組7只，C組6只，D組和E組各2只，F組6只。為使各組動物數均達5只，再依隨機分配原則選出A組2只，C組1只給D組；B組選2只，F組選l只給E組。為此，繼續抄下隨機數字分別除以A、B、C、F各組動物數。計算如下：56／7除盡，即將A組第7只動物(25號)給D組；50／6，余數為2，即將A組第2只動物(4號)給D組；26／6余數為2，即將C組第2只動物(9號)給D組。依次類推，最后調整分組如表4-5。

雌性動物也依上法分組。然后將雌、雄動物合組進行試驗。第四章食品毒理學實訓（3）編號及標記。

①染色法。第四章食品毒理學實訓②耳緣孔口法。大、小鼠常用此法。第四章食品毒理學實訓③烙印法。適用于兔以上的動物。④號牌法。適用于大動物。4.實驗動物被毛去除方法

方法有三種：剪毛、拔毛和脫毛。

5.實驗動物染毒方法

（1）灌胃法第四章食品毒理學實訓（2）吞咽膠囊。

（3）喂飼。

（4）小鼠腹腔注射法。(如圖4-12)

（5）小鼠皮下注射法。(如圖4-13)第四章食品毒理學實訓（6）小鼠尾靜脈注射法。（如圖4-14）

（7）小鼠腦室注射法。（如圖4-15）第四章食品毒理學實訓實訓三實驗動物解剖和生物樣本采集、

制備技術

一、預備知識實驗動物麻醉方法

（一）常用的麻醉劑

（1）揮發性麻醉劑：這類麻藥包括乙醚、氯仿等。

（2）非揮發性麻醉劑：種類較多，包括苯巴比妥鈉、戊巴比妥鈉、硫噴妥鈉等巴比妥類的衍生物，氨基甲酸乙酯和水合氯醛。

（3）中藥麻醉劑：如象洋金花、曼陀羅等。第四章食品毒理學實訓（二）動物的麻醉方法

1.全身麻醉

（1）吸入法。

（2）腹腔和靜脈給藥麻醉法。

2.局部麻醉

3.麻醉的注意事項

（1）注射必須緩慢，同時觀察肌肉緊張性、角膜反射和對皮膚夾捏的反應，當這些活動明顯減弱或消失時，立即停止注射。

（2）必須注意保溫。

（3）在寒冷冬季，麻醉劑在注射前應加熱至動物體溫水平。第四章食品毒理學實訓二、操作訓練：實驗動物解剖和生物樣本采集、制備技術

（一）實訓目的

（二）儀器和材料

（三）操作方法

1.采血

(1)鼠尾采血。

(2)眼眶靜脈叢（竇）采血。

(3)摘眼球采血。

(4)腹主動脈或股動(靜)脈采血。

(5)斷頭采血

(6)心臟采血。第四章食品毒理學實訓實驗動物每次采血量不能過多，表4-6是最大安全采血量。

2．血清與血細胞分離

(1)血清的制備

(2)血細胞分離。

3．尿液收集

(1)代謝籠法。（圖4-17）

(2)反射排尿法。第四章食品毒理學實訓4．處死

(1)頸椎脫臼法

。

(2)空氣栓塞法

。

(3)斷頭法

。

(4)急性放血法

。

(5)擊打法

。

(6)化學藥物致死法。

(7)麻醉致死法。

(8)其他：電擊法、槍擊法、微波法等。第四章食品毒理學實訓5.實驗動物的大體解剖

6.組織病理學檢查

7.組織勻漿的制備

(1)動物處死。

(2)臟器制備。

(3)勻漿制備。第四章食品毒理學實訓（四）實訓結果

(1)數據記錄，如下表所示，并計算臟體比（如肝／體比、腎／體比、脾／體比等)。

(2)器官顏色和形態描述。第四章食品毒理學實訓

實訓四

皮膚刺激試驗

一、預備知識：外源性化學物經皮膚吸收的途徑及影響因素

（一）外源性化學物經皮膚吸收的途徑

外源化學物經皮膚吸收的途徑：

①毒物通過表皮脂質屏障→角質層→透明層→顆粒層→生發層和基膜→真皮層→血液。

②毒物通過汗腺、皮脂腺和毛囊等皮膚附屬器，繞過表皮屏障直接進入真皮。第四章食品毒理學實訓第四章食品毒理學實訓圖4-18皮膚的基本組成（二）影響經皮膚吸收的因素

1.角質層受損時通透性就會提高，吸收增加。

2.接觸面積和皮膚的血流量。

3.在高溫高濕的氣象條件下，皮膚的血流量增加會提高吸收速率。

4.在酸、堿和皮膚刺激物對皮膚產生損傷后通透性也會明顯提高。

脂溶性毒物可經皮膚直接吸收，如芳香族的氨基、硝基化合物，有機磷化合物，苯及同系物等。個別金屬如汞亦可經皮膚吸收。某些氣態毒物，如氰化氫，濃度較高時也可經皮膚進入體內。第四章食品毒理學實訓二、操作訓練：皮膚刺激試驗

（一）實訓目的

（二）實訓原理

（三）儀器和材料

（四）操作方法

1.小鼠脫毛技術

方法有三種：剪毛、拔毛和脫毛。

2.小鼠染毒操作

（1）浸尾法。

（2）涂布法。

3.皮膚局部刺激作用的觀察方法和評價。（見表4-8、表4-9）第四章食品毒理學實訓第四章食品毒理學實訓4.實驗操作要點

5.注意事項

（五）實驗結果

觀察辣椒油對小鼠皮膚的刺激作用，并做出皮膚刺激性分級的判斷。第四章食品毒理學實訓實訓五經口急性毒性試驗

一、預備知識：食品毒理學實驗設計的幾個基本問題

（一）實驗的原則

在食品毒理學試驗中，有三個基本的原則。

1.化學物在實驗動物產生的作用可以外推于人。

2.實驗動物必須暴露于高劑量，這是發現對人潛在危害的必需的和可靠的方法。

3.選擇成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可能的暴露途徑。第四章食品毒理學實訓（二）實驗動物的選擇

1.物種的選擇

在毒理學研究中常用的實驗動物如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實驗動物有地鼠、獼猴、小型豬、雞等。

2.品系的選擇

品系(strain)指起源于一個共同祖先而具有特定基因型的一群動物。實驗動物按遺傳學控制分類可分為：（1）近交系。（2）雜交群動物(雜交1代，F1)。（3）封閉群。

遺傳毒理學一般利用嚙齒類動物，主要是小鼠或大鼠。如果有合適的理由，其他物種也可接受。第四章食品毒理學實訓3.對微生物控制的選擇

實驗動物按微生物控制分為四級，見表4-10。毒性試驗及毒理學研究應盡可能使用二級(或二級以上)的動物，以保證實驗結果的可靠性。第四章食品毒理學實訓4.個體選擇

實驗動物對外源化學物的毒性反應還存在個體差異。

（1）性別。

（2）年齡和體重。

（3）生理狀態。

（4）健康狀況。第四章食品毒理學實訓（三）毒理學試驗常用的對照

毒理學試驗常用的對照有4種：

1.未處理對照組(空白對照組)

2.陰性(溶劑/賦形劑)對照

3.陽性對照

4.歷史性對照第四章食品毒理學實訓二、操作訓練：經口急性毒性試驗

（一）實訓目的

（二）實訓原理

（三）儀器和材料

（四）操作方法及步驟

1.健康動物的選擇和性別鑒定。

2.實驗動物稱重、編號和隨機分組。

3.受試化學物溶液的配制。

4.小鼠灌胃操作技術。

5.毒性癥狀的觀察。第四章食品毒理學實訓6.注意事項。

（五）實驗結果

實驗結果按照表4-12的內容進行填寫。第四章食品毒理學實訓實訓六

經呼吸道急性毒性試驗

一、預備知識：呼吸道吸入染毒方式

（一）靜式吸入染毒

靜式吸入染毒系將實驗動物置于一個一定的體積的密閉容器內，加入定量的易揮發液態受試化合物或一定體積的氣態受試化合物，在容器內形成所需的受試化合物的空氣環境。接觸一定時間（一般為2h或4h）后，觀察動物的中毒反應，并根據動物的死亡情況和相應的受試物濃度，求出LC50。

染毒柜體積、放置動物種類和數量及放置時間相互關系見表4-13。第四章食品毒理學實訓第四章食品毒理學實訓染毒柜為有機玻璃制成，現有容積有60L和100L兩種規格。

柜頂蓋部有三個附件。一個是投藥孔，一個是用于混勻蒸氣或氣體的小電扇，一個是插入溫度計的孔。在柜壁上掛有一個小不銹鋼碟為接受和蒸發液態受試物的藥物蒸發器。（如圖4-19）第四章食品毒理學實訓（二）動式吸入染毒

動式吸入染毒設備由染毒柜、機械通風系統和配氣系統三部分構成對設備的要求較高，優點是在染毒過程中染毒柜內氧分壓及受試物濃度較穩定，缺點是消耗受試物的量大，并易于污染環境。動式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種，此設備設計為維持每小時12~15次的換氣，保證氧氣濃度為19%受試物的均勻分布。染毒柜應維持成輕微的負壓以免受試物從染毒柜逸出。要保證染毒柜中氣流的穩