DB37Identificationofcaprine，sheepandReal-timefluorescentPCRmet山東省市場監督管理局發布I 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 5 71羊奶中羊、大豆源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法本標準規定了羊奶產品中羊、大豆源性成分的實時熒光定性PC本標準適用于生鮮羊奶、滅菌液態羊奶、羊奶粉等羊奶制品中羊、大豆源性成分的定性檢GB/T6682分析實驗室用水規格GB/T27403實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測25.2材料103.4KPa蒸汽壓（121℃)滅菌20min，降至室溫，4℃保存備用。103.4KPa蒸汽壓（121℃)滅菌20min，室溫保存待用。0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉（pH8.0）溶液，再加入4mL聚乙二醇辛基苯基醚原液（溫度60℃),103.4KPa蒸汽壓（121℃)滅菌20min，降至室溫，4℃保存備用。6.4振蕩型恒溫金屬浴：0℃~100℃。36.6低溫冰箱：-20℃~4℃。6.8微量移液器：100μL～1000μL，10μL～200μL，2μL～20μL，0.5μL～10μL。6.9容量瓶：10mL，50mL，1將樣品于4℃、2500g離心30min；棄去離心管的上層乳脂和中間層乳液，保留其底部沉淀，向底部加lmLpH7.4滅菌的PBS緩沖液，將底部沉淀吹打懸浮并轉移至1.5mL的離心管中，離心力3500g，源性的特異探針，并加入內標質控體系。反應體系見附錄A中表A43000g離心1min，取出PCR9試驗數據處理9.2檢測結果分析和表述5A.1實時熒光定性PCR引物和探針序列AGAAAGAAGGCAAGCCCATCTGAAGACGAGAAGACCGTATGGAGGATTGCGCTGTTATCCCTAGACCGTTACCGAGTCCAGGTG5’FAM-CGCCGCTTCCTTCAACTTCACGCGGCG-5’ROX-CCACCAAGGGATAACAACACTCTGGTGG-5’CY5-CGACGGTCCTTTCTAATGTTGCGTCG-A.2實時熒光PCR反應體系加量(μL）221-3ng/μL2A.3對各種樣品檢測結果的判定6+-+未檢出大豆源性成分或含-+未檢出羊源性成分或含量++檢出大豆和羊源性成分未檢出大豆和羊源性成分-->35，判定為未檢出羊和大豆源性成分。---①如果同時進行的陽性對照實驗結果正常，②如果同時進行的陽性對照實驗結果不正常，7CTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGCCTTCAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAACTAGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTAAGGGATAACAACATCCTTTATGGACTAGCAGTTTTGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAAGAGATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACTTACAAGTCAAATCAAATTATCGCTTATTGATCCAAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAAGTAACTCAAGGAAAATAAATTCAACCACCAAGGGATAACAACACTCCTTATGAGTTAACAGTTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAGAAAATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACTAACAAGTCAAACCAAAGCTTATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCACCGTTACCGAGTCCAGGTGAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGACGACG