ICS65.020.20DB23052024-08-30發布雙鴨山市市場監督管理局發布IDB2305/T040—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由雙鴨山市農業農村局提出并歸口。本文件起草單位：黑龍江省農業科學院佳木斯分院、寶清縣小城子鎮鄉村振興發展服務中心、蕪湖職業技術學院。本文件主要起草人：楊曉賀、姚亮亮、于昌紅、顧鑫、吳彥龍、高忠臣、丁俊杰、高雪冬、邱磊、張茂明、王自杰、張家智、付久才、馬瑞、劉偉、王慶勝、黃成亮。DB2305/T040—20241水稻紋枯病菌分離及鑒定技術規程本文件規定了水稻紋枯病樣本的采集與保存，病原菌的分離、純化、鑒定及保存技術要求。本文件適用于水稻紋枯病菌的分離和鑒定。2規范性引用文件本文件沒有規范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1水稻紋枯病由立枯絲核菌侵染引起的一種水稻真菌病害，主要危害葉鞘、葉片形成云紋狀病斑。田間癥狀見附錄A。3.2單菌絲分離利用真菌培養時不產生分生孢子而產生快速生長菌絲的特點，切取菌絲前端進行菌絲分離，以獲得純化菌株。4儀器和用具4.1常用儀器4.1.1超凈工作臺潔凈等級100級@≥0.5um。平均風速0.25m/s～0.6m/s。4.1.2高壓滅菌鍋穩定范圍0℃~135℃。滅菌時間范圍4min～120min，最高工作壓力0.22MPa～0.25MPa。4.1.3光照培養箱穩定范圍0℃~50℃。穩定波動±1℃。光照度0LX～7500LX。2DB2305/T040—20244.1.4光學顯微鏡4.1.5電子天平感量0.01g。4.1.6常用工具剪刀、培養皿、吸水紙、接種針、試管、酒精燈、記號筆、載玻片、蓋玻片、鑷子，醫用紗布等。5樣本采集與保存水稻成熟期從田間剪取發病莖稈（其特征見附錄B），按品種及采集地裝入牛皮紙袋，貼上標簽，注明采集時間、地點和水稻品種，帶回實驗室。放置于4℃冰箱內保存備用。6分離技術6.1培養基的配制6.1.1水瓊脂培養基將20g瓊脂粉加水煮沸后定容至1000mL，配制成2%水瓊脂培養基。121℃濕熱滅菌25min。6.1.2馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）將去皮馬鈴薯200g切成小塊，加水1000mL煮沸25min，用四層紗布過濾，過濾后加入瓊脂20g，再煮沸后加入葡萄糖20g，加水定容至1000mL，121℃濕熱滅菌25min。6.2病菌分離將病組織用自來水沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水珠，將病組織剪成長寬各2mm×5mm的小塊，將其放置于水瓊脂平板上，每個平板放置5塊病組織，置于25℃光照培養箱內培養（見附錄C）。培養24h后，病組織周圍即可長出具有立枯絲核菌菌落特征的菌落（見附錄D），在無菌操作臺內切取菌落邊緣的菌絲前端，置于PDA平板上純化。6.3病菌的純化單菌絲分離將水稻紋枯病菌置于水瓊脂平板上，25℃培養2d后，用切刀切取菌絲前端約1mm長度的菌絲置于水瓊脂平板上，25℃培養。如此操作3次。7菌種保存DB2305/T040—20243將6.3純化的菌株轉入PDA試管斜面內，25℃培養15d，放置于4℃冰箱內保存備用（見附錄E）。8病原菌的鑒定形態學觀察法。選取干凈的載玻片，在載玻片上用吸管放置適量清水，挑起純化后的病原菌的菌絲放置清水上，蓋上蓋玻片，利用光學顯微鏡顯微觀察。參照立枯絲核菌形態學典型特征（附錄F）進行比對，確定其為水稻紋枯病菌。9病原菌的致病性測定將牙簽剪成1cm短簽，經121℃濕熱滅菌30min后，將短簽放置在PDA平板上，1個PDA平板內放置20個左右短牙簽。將待測菌株接種至裝有短牙簽的PDA平板內，28℃培養7d～10d，將帶有菌絲的短牙簽接種至水稻葉鞘內（見附錄G），接種72h后觀察，出現典型水稻紋枯病癥狀（附錄H），將發病葉鞘采集至實驗室，重復6.2、6.3和8操作，確定其為水稻紋枯病菌。4水稻紋枯病田間癥狀水稻紋枯病田間發病初期，葉鞘呈現云紋狀病斑，生育后期形成菌核。水稻紋枯病田間發病癥狀特征見圖A.1。圖A.1水稻紋枯病發病莖稈5水稻紋枯病發生于葉鞘、葉片及穗部。用于水稻紋枯病菌分離的標本以發病莖稈為宜。水稻紋6將清洗干凈并用吸水紙吸干水分的水稻紋枯病發病葉鞘樣本進行剪切，剪成2cm×5cm的小塊，將其放入水瓊脂平板上，每個平板放置5塊病組織，置于25℃培養箱內培養。分離培養皿內7立枯絲核菌菌落生長快，菌絲平鋪生長，起初白色，圖D.1為立枯絲核菌25℃培養36h菌落圖D.1立枯絲核菌25℃培養36h菌落特征8水稻紋枯病菌的保存純化的水稻紋枯病菌菌株轉入PDA試管斜面內，25℃培養15d,放置于4℃冰箱內保存備。圖E.14℃冰箱內保存30d的立枯絲核菌菌株PDA試管斜面9立枯絲核菌菌落生長快，菌絲平鋪生長，粉狀，起初白色，后逐漸變褐色，背面變褐；不育菌將牙簽剪成1cm短牙簽，短牙簽經121℃濕熱滅菌30min后，將牙簽放置在PDA平板上，1個PDA平板內放置20個左右短牙簽。將待測