1家禽細胞免疫應答評估方法的操作規范本文件適用于病原微生物抗原刺激下家禽的細胞免疫應答評GB/T6682分析實驗室用水規GB/T24863-2010畜禽細胞體外培養與冷凍保存一種來源于胸腺的淋巴細胞，在細胞免疫中發揮核心作用，分為CD4+T細胞、CD8+T細胞、又稱輔助性T細胞，表面帶有CD3和CD4受體，通過釋放多種細胞因子調又稱細胞毒性T細胞，表面帶有CD3和CD8受體，主要通過識別和殺傷病原體感染細胞，發揮免疫24縮略語AIV：禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus）APC：抗原遞呈細胞（Antigen-presentingCells）CXCLi2：CXC基序趨化因子配體2（CGranzymeA：顆粒酶A（GraGranzymeK：顆粒酶K（GranIL-1β：白細胞介素-1β（Interleukin-1BIL-2：白細胞介素-2（InterleukIL-4：白細胞介素-4（InterleukIL-5：白細胞介素-5（InterleukIL-6：白細胞介素-6（InterleukIFIT5：干擾素誘導蛋白5（Interferon-induceproteinwithtetratricIFN-α：干擾素-α（Interferon-AlphIFN-β：干擾素-β（Interferon-BIFN-γ：干擾素-γ（Interferon-GaMDA5：黑色素瘤分化相關基因5（Melanomadifferentiation-aMOI：感染復數（MultiplicityofInfection）NKlysin：自然殺傷細胞溶素基因（NKlysin）OASL：2'-5'-寡聚腺苷酸合成酶樣蛋白（2'-5'-OliPARP：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly(ADP-Ribose)PolymeraPBMCs：外周血單個核細胞（PeripheralBloodMPerforin：穿孔素（PerforiTCID50：半數組織培養感染劑量（50%TissueCultuTNF-α：腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactorTGF-β3：轉化生長因子-β3（TransformingGroTLR-3：Toll樣受體3（Toll-likeRecepto3TLR-7：Toll樣受體7（Toll-likeRecepto5外周血單個核細胞及脾臟單個核細胞分離技術5.1儀器與設備5.2試劑與耗材5.2.1雞外周血單個核細胞分離試劑盒/雞臟器組織單個核細胞分離試劑盒。5.3試驗方法5.3.1.1樣品稀釋5.3.1.2密度梯度離心5.3.1.3細胞收集與洗滌換PBS后重懸）。若出現紅細胞污染，可利用0.5mL5.3.1.4細胞重懸用1mLRP10培養基重懸細胞，計數后調整至1×106個/mL，放置于冰上待用。5.3.2.1脾臟收集5.3.2.2組織處理將脾臟剪成小塊，加入5mLRP10培養基。使用巴氏吸管輕輕吹打45.3.2.3密度梯度離心5.3.2.4細胞收集與洗滌吸取中間白色細胞層至新離心管中。加入PBS洗滌），若出現紅細胞污染，可利用0.5mL紅細胞裂解液重懸細胞3min，然后加入PBS額外洗滌一步進行去除。5.3.2.5細胞重懸5.3.2.6分層效果評估5.4結果判定5.4.1.1計數方法釋后的細胞懸液與10μL染液1:1混合，5.4.1.2細胞分離質量判定存活率需保持在90%以上，且每個樣品的細胞6.2.1MouseAnti-ChickenCD3-APC6.2.2MouseAnti-ChickenCD4-FITC6.2.3MouseAnti-Ch5從家禽外周血（每組應不少于6只雞/鴨的個體重復）或脾臟（每組應不少于3只雞/鴨的個體重復）分離PBMCs或脾臟單個核細胞，并使用淋巴Buffer洗滌2次后調整細胞濃度至不少于1×106個細胞/mL，流式細胞儀收集細胞的數量應不少于3×105，以保證信號的可靠性。每管加入1×106個PBMCs或脾臟單個核細胞于流式細胞儀專用檢測管中，使用下列抗體孵育：APC用流式Buffer洗滌3次：每次加入流式Buffer將洗滌后的細胞重懸于500μL流式Buffer。使用流式細胞儀進6.4.1數據處理：數據以百分比表示，統計樣本中CD3+CD8+T細胞、CD3+CD4+T細胞及6.4.2實驗對照：設置未標記樣本（陰6.4.3實驗效果評估：與無抗原刺激組（對照組）相比，抗原刺激組（或處理組）CD3+CD8+T細胞、CD3+CD4+T細胞及CD3+CD4+CD8+細胞的比例有顯著差異（P＜0.05或0.01或0.001），若67.2.1MouseAnti-ChickenCD3-AP7.2.2MouseAnti-ChickenCD4-FI7.2.5羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluoresceinsuccinimidylester，CFSE）。取6×105細胞/孔于15mL生化管中，病毒常規感染細胞后，繼續孵育7.3.2.2.1將從病原感染或免疫的家禽中分離記憶性PBMC7.3.2.2.2按以下分組設計實驗，每7.3.2.3.1每天使用倒置顯微鏡觀察細胞的7.3.2.3.2每日取細胞懸液，用0.08離心管用5mL預熱的PBS重懸1×107個細胞，另取一個15mL離心管用5mLPBS稀釋CFSE，將兩管混合7T細胞和CD3+CD4+CD8+T細胞比例和絕對數量的變化。7.4.1形態學變化：利用顯微鏡觀察刺激后細胞的形態學變化，病毒刺激組和7.4.2CFSE標記檢測：病毒刺激組和ConA刺激組的細胞會出現多個增殖峰，7.4.3流式細胞術檢測T細胞比例及絕對數量的變化：與未刺激激組的T細胞比例和絕對數量會顯著增加，如附錄A8.2.1雞IFN-γELISpotB8.3.2孔板封閉：用RP-10在室8PMA+Ionomycin（10μg/mL）。實驗組：病毒或抗min，避免過度顯色導致背景增加。反應完成后8.3.5.1斑點計數：使用酶聯免疫斑點分析儀計數斑點數量，記錄各孔數據。8.4.1斑點計數：使用酶聯免疫斑點計數儀2個生物學樣本中誘導了顯著的IFN-γ產生，則說明抗原可以刺激細胞毒性9.1儀器和設備9.1.1細胞培養箱。9.1.2離心機。9.1.3移液器。9.1.4流式細胞儀。9.2試劑與耗材9.2.1MouseAnti-Chicken9.2.2RabbitAnti-Chi9.2.3MouseAnti-Chick9.2.4GoatAnti-Rabbit9.2.6離心管。9.3試驗方法9.3.1細胞培養9.3.2抗原再刺激及封閉9按照章節7中的方法進行APC的孵育，按用每孔100μLT細胞培養基重懸APC后加入到培養的細胞中，同時按照1：1000的比例加入BFA共孵育6h。9.3.3表面標志物染色取細胞用流式Buffer洗滌3次：每次加入PBS至1mL，輕輕混勻后以400g/min離心5min。棄上清后用T細胞表面標記抗體（如TCRγδ,CD8用流式Buffer清洗細胞3次后，按照1×106個細胞/100μL細胞固定破膜劑重懸細胞，4℃避光孵育209.3.5胞內標志物染色孵育30min，輕輕混勻避免細胞沉淀。離心后用山9.3.6數據分析9.4結果判定9.4.2實驗對照：設置未標記樣本（陰性對照）和單通道抗體染色標記樣本（用于補償計算）。9.4.3結果分析：按照上述方法進行檢測，陽性樣本會出現明顯的分群，與未刺激組相比，刺激組中產生IFN-γ的T細胞百分比顯著上調（P＜0.05或0.01或0.0），根據RNA逆轉錄試劑盒產品說明書進行，使用PCR擴增儀實時熒光定量PCR儀自動記錄Ct值，采用2-ΔΔCt方法計算相對表達量：相對表達量=2?ΔΔCt使用GraphPadPrism繪制基因表達差異數據用平均值(±)標準誤表示，使用單因素方差分析（ANOVA用于比較3個或3個以上處理組之間的差異）或t檢驗進行組間（用于比較兩個處理組之間調（P＜0.05或0.01或0.001），表明刺激了細胞毒性T細胞免疫應答反應；若是Th2細胞因子上調），10.4.4.2熔解曲線：檢查特異在培養第4天，使用無菌管收集細胞培養上清，400g/min離11.3.4.1試劑準備：使用前充分混勻試劑，避免產生氣11.3.4.5酶結合反應：每孔加入80μL鏈酶親和素-HRP溶液，輕輕混勻后37℃溫育30min。采用GraphPadPrism軟件繪制柱狀圖，展示不同實驗組間的基因或蛋白表達之間的差異）或t檢驗進行組間（用于比較兩個處理組之間通過樣品的基因或蛋白表達水平判斷免疫反應狀態。與未刺激組種或多種實驗技術監測家禽T細胞產生效應因子，均可說明家禽T細胞在抗原刺激后產生效應應答。若要監測特定T細胞亞類產生效應應答，則只能通過IFN-γICS方法檢測，或流式分選NM_204305.1NM_001024836.1NM_