2.1植物細胞工程的基本技術

細胞工程是指應用細胞生物學、分子生物學和發育生物學等多學科的原理和方法，通過細胞器、細胞或組織水平上的操作，有目的地獲得特定的細胞、組織、器官、個體或其產品的一門綜合性的生物工程。原理和方法操作水平目的分類細胞生物學、分子生物學和發育生物學細胞器、細胞或組織獲得特定的細胞、組織、器官、個體或其產品動物細胞工程和植物細胞工程細胞工程植物細胞工程發展歷程哈伯蘭特提出了細胞全能性的理論，但相關的實驗嘗試沒有成功。斯圖爾德等發現胡蘿卜的體細胞可以分化為胚，為細胞全能性理論提供了強有力的支持。科金用真菌的纖維素酶分解番茄根的細胞壁，成功獲得了原生質體。古哈等在培養毛曼陀羅的花藥時，首次得到了由花藥中的花粉粒發育而來的胚。卡爾森誘導煙草種間原生質體融合，獲得了第一株體細胞種間雜種植株。土壤農桿菌的Ti質粒被發現。之后，該質粒應用于植物分子生物學領域，促進了植物細胞工程與分子生物學技術的緊密結合。1902年1958年1960年1964年1971年1974年從社會中來---蘭花-高潔、典雅的象征

蘭花種子通常發育不全，在自然條件下萌發率極低；傳統分株繁殖的方法又存在繁殖周期長、繁殖率低等問題。如何讓名貴的蘭花大量、快速繁殖，走入尋常百姓家？——植物組織培養技術鬼蘭（幽靈蘭）1500萬每株！播種或扦插播種或扦插一片花瓣一個細胞細胞具有全能性一粒花粉2.體現全能性的標志：1.定義：細胞→完整個體或其他各種細胞細胞經過分裂和分化后，仍然具有產生完整生物體或分化成其他各種細胞的潛能，即細胞具有全能性。一、細胞的全能性①胡蘿卜韌皮部細胞發育成完整植株②受精卵發育成個體（動植物）③蜜蜂受精卵發育成工蜂，卵細胞發育成雄峰④用一片葉子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株3.細胞具有全能性的原因：一般來說，生物體的每個細胞中都含有發育成為完整個體所需的全部遺傳信息。不是每個活細胞都有全能性，例如哺乳動物成熟的紅細胞。5.細胞全能性大小的比較：一般來說，細胞分化程度越高，全能性

；隨著細胞分化程度的不斷提高，細胞的分裂能力和全能性

。越低逐漸降低(1)不同種生物細胞：(2)同種生物不同細胞：植物細胞

動物細胞受精卵

生殖細胞

體細胞＞（動物細胞目前只有細胞核能體現全能性）＞(3)同種生物不同體細胞的全能性大小：幼嫩的細胞

衰老的細胞＞＞

思考：生物體內所有細胞都能表現出全能性嗎？芽原基只能發育為芽，葉原基只能發育為葉4.細胞沒有體現全能性的原因：在特定時間和空間條件下，細胞中的基因會選擇性表達。二、植物組織培養技術2.原理：1.概念：指

的植物器官、組織或細胞等，培養在人工控制的培養基上，給予適宜的培養條件，誘導其分化為

的技術。離體完整植株植物細胞的全能性外植體外植體：在植物組織培養過程中，從植物體上被分離下來的，接種在培養基上供培養用的原生質體、細胞、組織、器官等。3.生殖方式：無性生殖4.分裂方式：有絲分裂4.植物組織培養的流程：接種外植體脫分化誘導愈傷組織誘導生芽再分化移栽成活該實驗具體如何操作呢？離體培養的植物器官、組織或細胞。離體條件下已分化的細胞經過誘導，失去特有的結構和功能，重新獲得分裂能力。不定形的薄壁組織團塊。（細胞排列疏松且無規則、高度液泡化、無葉綠體。）再分化愈傷組織能重新分化成芽、根等器官。誘導生根【探究·實踐】——菊花的組織培養1.實驗原理：植物細胞一般具有

。全能性注意：植物激素中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵激素，它們的濃度、比例等都會影響植物細胞的發育方向。生長素/細胞分裂素

結果比值高(＞1)比值低(＜1)比值適中(=1)有利于根的分化，抑制芽的形成有利于芽的分化，抑制根的形成促進愈傷組織的形成生長素類作用：用于誘導細胞的伸長生長和根的分化；細胞分裂素類作用：促進組織細胞的分裂或從愈傷組織和器官上分化出不定芽。巧記：高根低芽中愈傷①外植體：幼嫩的菊花莖段(細胞分裂能力強，容易誘導形成愈傷組織)②體積分數為70%的酒精：對手、超凈工作臺、外植體進行消毒③質量分數為5%左右的次氯酸鈉溶液:對外植體進行消毒④無菌水:清洗外植體⑤培養基：MS培養基（P116--參見本書附錄1）包括無機營養成分（水和無機鹽）、有機營養成分（蔗糖、氨基酸、維生素等）、特定濃度和比例的激素（主要是生長素和細胞分裂素）；滅菌方法為：高壓蒸汽滅菌法2.材料用具：（1）培養基名稱：

；（2）物理性質：

；（3）碳源：

。附錄1：植物組織培養常用的培養基配方（P116）MS培養基

固體培養基有機碳源（蔗糖）①無機營養成分(水和無機鹽)②有機營養成分(蔗糖、氨基酸、維生素等)③特定濃度和比例的激素(主要是生長素和細胞分裂素)（1）消毒雙手和超凈工作臺臺面:用酒精擦拭外植體:①流水沖洗②酒精消毒30s→③立即用無菌水清洗2～3次④次氯酸鈉溶液處理30min→⑤立即用無菌水清洗2～3次。（2）外植體切段將消過毒的外植體置于無菌的培養皿中→用無菌濾紙吸去表面的水分→用解剖刀將外植體切成0.5～1cm長的小段。3.操作步驟：（3）接種到誘導愈傷組織培養基

在酒精燈火焰旁，將外植體的1/3~1/2插入誘導愈傷組織的培養基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養瓶上作好標記。注意：將“形態學上端”朝上，下端朝下（4）脫分化——誘導愈傷組織

將接種了外植體的錐形瓶或植物組織培養瓶置于18～22℃的培養箱中培養。在培養過程中，定期觀察和記錄愈傷組織的生長情況。注意：該過程一般不需要光照，有光易形成維管組織，不易形成愈傷組織。（5）再分化——誘導生芽生根

培養15～20d后，將生長良好的愈傷組織轉接到誘導生芽的培養基上培養。

長出芽后，再將其轉接到誘導生根的培養基上，進一步誘導形成試管苗。【注意】該過程每日需要給予適當時間和強度的光照！原因：誘導葉綠素的合成，使試管苗能夠進行光合作用過程中涉及的生命活動：既有細胞增殖（有絲分裂），又有細胞分化。（6）移栽培養

移栽前先打開封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養箱內生長幾日。

用流水清洗掉根部的培養基后，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環境中，待其長壯后再移栽入土。

每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花。胚狀體：離體培養條件下，沒有經過受精過程，但經過胚胎發育過程形成的胚狀類似物，因而統稱為體細胞胚或胚狀體。胚狀體途徑器官發生途徑外植體脫分化愈傷組織再分化生芽生根或胚狀體生長發育試管苗（移栽到大田）拓展：植物組織培養的兩種途徑【總結】植物組織培養中細胞表現出全能性的條件（1）離體狀態（最關鍵）（2）嚴格的無菌條件：①對操作環境、雙手、外植體進行消毒；②對培養基和器械進行滅菌；③接種操作必須在酒精燈火焰旁進行。（3）適宜的培養條件：（4）適宜濃度和比例的激素：（5）一定的營養條件：溫度，PH、光照等包括有機營養成分、無機營養成分主要是生長素和細胞分裂素1．青蒿素是有效治療瘧疾的藥物，幾乎不溶于水，且遇熱不穩定，所以提取工藝一直難以突破。下圖表示科研人員獲得青蒿素含量較高的黃花蒿的植物組織培養流程。下列敘述不正確的是(

)A．選取黃花蒿的分生區組織作為外植體更易得到愈傷組織B．過程②和過程③分別代表脫分化和再分化過程C．從愈傷組織中提取青蒿素效果不理想，與相關基因的表達情況有關D．除向①②過程培養基添加營養物質外，還需添加生長素和細胞分裂素【現學現用】B2.如圖所示為菊花組織培養的過程，下列敘述錯誤的是(

)A.①過程用酒精、次氯酸鈉等對生理狀況良好的嫩枝莖段進行表面消毒B.通過③過程葉肉細胞失去了其特有的結構和功能C.④過程需要先誘導生根，長出根后再誘導生芽D.⑤過程移栽前需要先打開封口膜或瓶蓋讓試管苗適應外界環境C3.培養胡蘿卜根組織可獲得試管苗，獲得試管苗的過程如圖所示。回答下列問題。（1）利用胡蘿卜根段進行組織培養可以形成試管苗。用分化的植物細胞可以培養成完整的植株，這是因為植物細胞具有__________。（2）步驟③切取的組織塊中要帶有形成層，原因是________________________________。（3）從步驟⑤到步驟⑥需要更換新的培養基，其原因是_____________________________________________________________________________________________________________________。（4）步驟⑥要進行照光培養，其作用是_____________________________________________________。（5）經組織培養得到的植株，一般可保持原品種的________________________，這種繁殖方式屬于____________繁殖。全能性形成層容易誘導形成愈傷組織遺傳特性

無性

誘導愈傷組織形成和誘導愈傷組織分化形成試管苗所需的生長素和細胞分裂素的比例不同誘導葉綠素的形成，使試管苗能夠進行光合作用三、植物體細胞雜交技術西紅柿土豆1.要培育出如圖所示的番茄—馬鈴薯利用傳統有性雜交方法能實現嗎？科學家欲利用番茄和馬鈴薯培育出地上長番茄和地下結馬鈴薯的“超級作物”。不能。因為不同種生物之間存在著生殖隔離2.有沒有方法可以打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，獲得“番茄-馬鈴薯雜種植株”呢？植物體細胞雜交技術

1.概念：將__________的植物體細胞，在一定條件下融合成____________，并把雜種細胞培育成__________的技術。無性生殖不同來源雜種細胞新植物體融合實例:+=白菜甘藍白菜-甘藍三、植物體細胞雜交技術2.過程：（1）去除細胞壁B細胞A原生質體B原生質體去壁去壁A細胞方法：酶解法（用纖維素酶和果膠酶）細胞壁（纖維素和果膠）酶溶液中一般加入一定濃度的無機鹽離子和甘露醇，維持滲透壓，防止原生質體吸水過多而漲破。注意：區分原生質體和原生質層細胞壁細胞膜細胞質液泡細胞核指的是脫去細胞壁的細胞。包括：細胞膜、細胞質、細胞核。原生質體成熟植物細胞的細胞膜、液泡膜和介于這兩層膜之間的細胞質。原生質層原生質層2.過程：（2）誘導融合B細胞A原生質體B原生質體去壁去壁A細胞正在融合的原生質體融合方法：細胞膜具有流動性①物理法：電融合法、離心法等②化學法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+—高pH融合法原理：2.過程：（3）細胞壁再生：B細胞A原生質體B原生質體去壁去壁A細胞正在融合的原生質體融合再生出細胞壁雜種細胞②新細胞壁的形成與哪些細胞器有關：_____________________高爾基體、線粒體①融合完成的標志：_____________________________________融合的原生質體再生出新的細胞壁2.過程A細胞B細胞A原生質體B原生質體正在融合的原生質體雜種細胞愈傷組織雜種植株移栽后的植株①①②③④⑤⑥①去除細胞壁②誘導融合③細胞壁再生④脫分化⑤再分化⑥移栽植物細胞融合植物組織培養（4）植物組織培養植物細胞融合完成的標志：融合的原生質體再生出新的細胞壁植物體細胞雜交完成的標志：培育成新植物體在此過程中活躍的細胞器是

。線粒體和高爾基體3.原理：體細胞雜交利用了細胞膜的_________，雜種細胞培育成雜種植株利用了植物細胞的__________。全能性流動性4.標志：5.優點和局限性①優點：打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，培育植物新品種。②局限性：目前有許多理論和技術問題未解決，還不能讓雜種植株按照人們的需求表現出雙親的雜合性狀。融合細胞類型的分析1.只考慮兩兩融合,

A種原生質體與B種原生質體可以形成幾種融合細胞？而我們需要的是哪種類型？所以原生質體融合后，我們要進行怎樣的處理？有

種融合類型：AA、BB、AB我們需要的是？AB3培養基中共有

種類型的細胞？因此要對融合后的原生質體進行

。篩選AA、BB、ABA、B5+=白菜甘藍白菜-甘藍2.白菜（2N=18）與甘藍（2N=18）體細胞雜交所得植株白菜-甘藍的細胞染色體數為

，屬于

倍體。36

（異源）四

3.白菜（2N=18）與甘藍（2N=18）進行雜交（相互授粉），所得植株白菜-甘藍的細胞染色體數為

，屬于

倍體。（異源）二

18

染色體變異基因重組(1)高度分化的細胞，只有發育成一個完整的生物個體，才能體現出細胞的全能性。()(2)植物組織培養技術的理論基礎是植物細胞的全能性。()(3)植物激素中的生長素和赤霉素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵激素。()(4)植物體細胞雜交就是利用一定的方法將去除細胞壁的不同來源的植物細胞融合為雜種細胞的過程。()(5)若原生質體均為兩兩融合，則融合后的細胞有3種類型。(

)×√××√1．易錯辨析【現學現用】2.下圖是利用甲、乙兩種植物的各自優勢，通過植物細胞工程技術培育高產、耐鹽的雜種植株的實驗流程圖。下列相關敘述錯誤的是（）

A.進行a處理時能用胰蛋白酶

B.b