ICS?FORMTEXT點擊此處添加ICS號FORMTEXT點擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻分類號FORMTEXT?????DBFORMTEXT??DBFORMTEXTXX/FORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????FORMTEXT家畜化膿隱秘桿菌病診斷技術(shù)FORMTEXTDiagnostictechniquesforTrueperellapyogenesdiseaseinlivestockFORMTEXT點擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識FORMDROPDOWNFORMTEXT?????FORMTEXT????-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施FORMTEXT????????發(fā)布DBXX/XXXXX—XXXXI前??言本文件按照GB/T草。本文件由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口；本文件起草單位：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、贛州市畜牧業(yè)發(fā)展和動物疫病防控中心。本文件主要起草人：譚美芳、楊群、曾艷兵、李海琴、季華員、譚佳、張帆帆、方紹培、黃美峰、吳誠誠、饒煜玲。家畜化膿隱秘桿菌病診斷技術(shù)?????范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了家畜化膿隱秘桿菌病診斷的操作程序和判定標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛、羊、豬等經(jīng)濟型家畜化膿隱秘桿菌病的診斷、檢疫及流行病學(xué)調(diào)查。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件：化膿隱秘桿菌病（Trueperellapyogenesdisease）是指由化膿隱秘桿菌（Trueperellapyogenes）感染動物引起的以化膿性炎癥為主的傳染病，常導(dǎo)致牛、羊、豬等多種經(jīng)濟型家畜和野生動物的化膿性肺炎、子宮內(nèi)膜炎、乳房炎、皮下膿腫、流產(chǎn)和死胎等，嚴重時可引發(fā)敗血癥而死亡。試劑與器材試劑普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板：配制方法參見附錄A革蘭氏染色試劑盒、細菌微量生化鑒定管：生物試劑公司生產(chǎn)消毒水、75%酒精、甘油（分析純）、0.85%生理鹽水、無菌雙蒸水2×TaqPCRMasterMix（含染料）、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品、1×電泳緩沖液、瓊脂糖、核酸染料器材超凈工作臺、臺式高速冷凍離心機、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、冰箱（4℃、-20℃或-80℃）、PCR擴增儀、水浴鍋、電子天平、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、pH計、滅菌鍋解剖手術(shù)刀、剪刀、鑷子、接種環(huán)、酒精燈、一次性注射器（10mL）、輸精槍微量移液器（10μL、50μL、200μL、1000μL）無菌塑料制品：培養(yǎng)皿（直徑90mm）、吸頭、離心管（2mL）、PCR管、塑封袋、一次性手套臨床診斷流行病學(xué)化膿隱秘桿菌屬于條件性致病菌，可持續(xù)存在于易感動物的皮膚、上呼吸道、泌尿和生殖道等黏膜表面，常呈散發(fā)；病原菌可通過患病動物上呼吸道、乳房、外陰等的分泌物和糞便排出，直接或間接通過飲水器和其他污染物傳播；該菌還可通過打耳號、去勢等途徑感染。臨床癥狀化膿性肺炎病畜體溫升高至40℃左右，食欲減退并伴有咳喘、流涕、呼吸急促等呼吸道癥狀，漸進性消瘦；隨著病程延長，病畜呼吸衰竭而亡。子宮內(nèi)膜炎臨床上常見奶牛、母羊和母豬因化膿隱秘桿菌感染導(dǎo)致的急性細菌性子宮內(nèi)膜炎，延誤治療或治療不當(dāng)則轉(zhuǎn)化為慢性子宮內(nèi)膜炎。患病母畜輕者無全身癥狀，發(fā)情正常，但屢配不孕或配種后容易發(fā)生流產(chǎn)、死胎等；嚴重的伴有全身癥狀，如精神沉郁，體溫升高，呼吸加快，食欲下降，反芻無力等表現(xiàn)，發(fā)情微弱或不發(fā)情。化膿性乳房炎臨床上常見奶牛“夏季乳房炎”，也稱為“未經(jīng)產(chǎn)牛乳房炎”或“化膿棒狀桿菌乳房炎”，是停乳期奶牛和青年母牛發(fā)生在夏季的乳腺化膿性炎癥，在蚊蠅的協(xié)助下發(fā)生“牛-牛傳播”。乳用山羊、綿羊和馬也有發(fā)生。發(fā)病初期,患病母畜一個或多個乳區(qū)發(fā)生炎癥和水腫,乳房分泌物變色、黏稠，呈奶油樣或漿液樣，且常伴有惡臭味；進而乳區(qū)變松軟，膿腫向外破潰，并表現(xiàn)出全身癥狀，發(fā)熱、食欲不佳、反芻停止、昏迷等；有時可見母牛后肢關(guān)節(jié)腫脹，發(fā)生漸進性跛行；個別病牛發(fā)生敗血癥而死亡。化膿性關(guān)節(jié)炎常見于犢牛和仔豬，患病動物精神沉郁，采食量下降，關(guān)節(jié)腫脹，跛行或不能站立。皮下或肌肉膿腫常見于反芻動物、豬和野生動物（如林麝、鹿、狐、貂等）等，因化膿隱秘桿菌感染動物受損的皮膚或黏膜所引起的慢性傳染性疾病，僅會造成動物體質(zhì)衰弱，通常不會引起臨床癥狀；頰部、體表、淋巴結(jié)等皮下部位的膿腫肉眼可見，肌肉膿腫僅在屠宰或尸檢時能被發(fā)現(xiàn)。病理學(xué)變化化膿性肺炎剖檢可見喉頭及氣管中存在泡沫樣黏液；胸腔有膿性渾濁積液，胸膜增厚；肺部表面有大小不等的黃白色膿腫或壞死灶、間質(zhì)增寬并伴有不同程度的充血、實質(zhì)性肉變。部分病例可見肝臟、脾臟、淋巴結(jié)彌漫性出血、腫大；腹腔內(nèi)積有膿液，腸道液化。子宮內(nèi)膜炎陰道檢查可見膿性排出物，子宮頸口不同程度的腫脹和充血；病畜發(fā)情期分泌物量多，不能成拉絲狀；或量少、粘稠、渾濁、呈灰白色或灰黃色。化膿性乳房炎切開病畜乳房可見乳腺組織內(nèi)有大小不等的化膿灶，呈彌散分布，其內(nèi)充滿黃白色或黃綠色的膿性滲出物。化膿性關(guān)節(jié)炎剖檢可見關(guān)節(jié)腔內(nèi)有膿汁，關(guān)節(jié)軟骨上有黃色干酪樣物。皮下或肌肉膿腫剖檢可見膿腫從幾毫米至幾厘米大小不等，常有較厚的纖維素包膜，并含有粘稠程度不一的乳白色或黃綠色膿汁。淋巴結(jié)膿包病例剖檢還可見淋巴結(jié)被大量結(jié)締組織包裹，質(zhì)地堅硬，內(nèi)含白色或灰白色的牙膏狀膿汁。病原菌的分離培養(yǎng)采樣發(fā)病畜樣品采集采樣前將家畜固定，用毛刷刷去其身體和乳區(qū)粘附的污物，并用溫水將膿包、生殖道口或乳房擦洗干凈，再用消毒液和75%酒精充分消毒取樣部位，帶上無菌手套進行后續(xù)操作：膿汁的采集：用無菌注射器緩慢抽出膿液，注入無菌的離心管中。乳汁的采集：人工擠乳，棄去頭3股乳汁，將第4股乳汁用無菌的離心管接住。陰道分泌物的采集：將套有無菌管套的輸精槍插入子宮體，然后將輸精槍抽出，用10mL無菌注射器對準(zhǔn)管套口將子宮黏液吸出，注入無菌的離心管中。死亡畜樣品采集按照NY/T541的要求，無菌采集病變的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等小塊組織，放入無菌塑封袋中；胸腔積液、關(guān)節(jié)液和膿汁等液體樣品放入無菌的離心管中。樣品的保存樣品于2℃～8℃保存，并在24h內(nèi)送至實驗室進行細菌的分離培養(yǎng)。如果在24h內(nèi)不能送達的，應(yīng)將組織塊剪碎后，加入無菌的終濃度為50%甘油的生理鹽水；液體樣品以1:1的體積比例加入無菌的含50%甘油的生理鹽水。混勻后放-20℃或者-80℃長期保存。細菌分離培養(yǎng)接種樣品接種應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)進行。用無菌鑷子和剪刀處理組織病料，露出新的無菌切面，用灼燒后的接種環(huán)自切面處伸入組織內(nèi)部，然后劃線接種于普通瓊脂平板和鮮血瓊脂平板；液體樣品直接用無菌接種環(huán)蘸取后劃線。菌落形態(tài)觀察接種后的平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h，觀察菌落特征。普通瓊脂平板上不生長，鮮血瓊脂平板上形成的菌落形態(tài)單一，呈白色或灰白色，圓形，濕潤，半透明，表面光滑隆起，直徑約1mm，且菌落周邊形成透明的β-溶血環(huán)，則為化膿隱秘桿菌疑似菌落。病原菌的鑒定染色鏡檢革蘭氏陽性，無莢膜，無芽孢，呈散在分布，形態(tài)不均一的棒狀短桿菌。生化鑒定生化試驗挑取符合4.2特征的可疑菌落，按照商業(yè)化的生化反應(yīng)管說明書進行生化試驗。生化特性參照試劑盒內(nèi)說明書的判定標(biāo)準(zhǔn)，記錄生理生化試驗結(jié)果。化膿隱秘桿菌生化反應(yīng)結(jié)果生化試驗項目反應(yīng)結(jié)果生化試驗項目反應(yīng)結(jié)果葡萄糖+甘露醇－蔗糖+尿素－乳糖+甲基紅試驗+半乳糖+吲哚實驗－麥芽糖+硝酸鹽還原試驗－棉籽糖－觸酶試驗－果糖+VP試驗－山梨醇+七葉苷－結(jié)果判定若疑似菌落的生化特性與標(biāo)準(zhǔn)化膿隱秘桿菌生化特性（表1）一致，可確認該菌為化膿隱秘桿菌。PCR鑒定模板制備挑取化膿隱秘桿菌疑似菌落，或挑取符合表1生化特性的菌落，懸浮于1mL滅菌的0.85%生理鹽水中，充分打散制成菌懸液，在4℃條件下12000r/min離心5min，棄上清。加入50μL無菌雙蒸水，重懸菌體，水浴煮沸10min，然后冰浴10min，在4℃條件下12000r/min離心5min，上清液為DNA模板，用于后續(xù)PCR擴增。對陽性對照（化膿隱秘桿菌ATCC49698）同步進行模板提取。引物序列檢測基因是化膿隱秘桿菌保守的特異性基因plo（溶血素編碼基因）。上游引物序列：5'-TCATCAACAATCCCACGAAGAG-3'；下游引物序列：5'-TTGCCTCCAGTTGACGCTTT-3'。擴增片段大小為150bp。反應(yīng)體系每個樣品建立25μLPCR反應(yīng)體系，見表2。用無菌雙蒸水作為陰性對照。化膿隱秘桿菌plo基因擴增體系配置表試劑名稱加樣體積/μL2×TaqPCRMasterMix12.5上游引物（10μmol/L）1下游引物（10μmol/L）1DNA模板2滅菌去離子水8.5PCR循環(huán)條件預(yù)變性94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸10min，結(jié)束反應(yīng)，4℃保存。PCR產(chǎn)物電泳用電泳緩沖液配制1.5%瓊脂糖凝膠，加熱融化后，添加工作濃度的核酸染料，凝固備用。取6μLPCR產(chǎn)物加入加樣孔，同時加DNAmarker作為分子量參考。5V/cm恒壓下電泳20min～30min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察分析電泳結(jié)果。結(jié)果判定陽性對照擴增出150bp的條帶，同時陰性對照未見有PCR擴增條帶，檢測結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)與陽性質(zhì)控同樣大小的條帶時，判為陽性；被檢樣品未出現(xiàn)與陽性質(zhì)控同樣大小的條帶時，判為陰性。綜合判定符合5規(guī)定的流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化，判定為臨床疑似病例。臨床疑似病例按6規(guī)定的進行細菌的分離培養(yǎng)，經(jīng)7.1染色鏡檢后，用7.2和7.3中的任一方法檢測，結(jié)果為陽性者，可確診為化膿隱秘桿菌病。注意事項實驗室生物安全要求按照GB19489執(zhí)行。

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基的配制普通瓊脂平板成分蛋白胨10g牛肉膏5g氯化鈉5g瓊脂10g~15g蒸餾水1000mL制法將除瓊脂以外的的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，調(diào)pH至7.2~7.4。加入瓊脂，121℃高壓滅菌15min。高壓后的培養(yǎng)基冷卻至50℃~60℃，于超凈工作臺中傾注到直徑為90mm的無菌塑料平皿中。待瓊脂充分冷卻成形后，將平板倒置于4℃冰箱內(nèi)備用。現(xiàn)有廠家專門配制、出售普通瓊脂干粉劑，用時按說明書稱取，加水溶解，滅菌后即可。鮮血瓊脂平板