第二節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用（二）二、微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當(dāng)要分離的微生物在混合的菌群中不是優(yōu)勢(shì)種群時(shí)，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實(shí)現(xiàn)。該怎么辦呢？（一）選擇培養(yǎng)基1、Taq酶的篩選

2、實(shí)驗(yàn)室微生物篩選的原理3、選擇培養(yǎng)基4、思考討論1、Taq酶的篩選

1973年，科學(xué)家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進(jìn)而從這種菌中提取出耐高溫的DNA聚合酶

（Taq酶）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫的DNA聚合酶。篩選原因：水生棲熱菌能在70-80℃高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。美國黃石公園2、實(shí)驗(yàn)室微生物篩選的原理實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選，也可以應(yīng)用同樣的原理，即人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。3、選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會(huì)被土壤中的某些細(xì)菌分解成NH3，再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕福迕复呋蛩胤纸猱a(chǎn)生NH3，NH3可以作為細(xì)菌生長的氮源。

討論：1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計(jì)？

●設(shè)計(jì)一種選擇培養(yǎng)基，用尿素作為唯一氮源，可以將分解尿素的細(xì)菌分離出來。CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3脲酶選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會(huì)被土壤中的某些細(xì)菌分解成NH3，再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕福迕复呋蛩胤纸猱a(chǎn)生NH3，NH3可以作為細(xì)菌生長的氮源。

討論：2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？

●這種培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基相比，只是用尿素作為唯一氮源，培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分基本相同。CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3脲酶（二）微生物的選擇培養(yǎng)1、微生物選擇培養(yǎng)的其他條件

2、稀釋涂布平板法1、微生物選擇培養(yǎng)的其他條件

如果想要知道1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌，僅有選擇培養(yǎng)基是不夠的，還需要對(duì)土樣進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚硪约翱茖W(xué)的測(cè)定微生物數(shù)量的方法。2、稀釋涂布平板法由于土壤中細(xì)菌數(shù)量龐大，想要得到能分解尿素的細(xì)菌的純培養(yǎng)物，必須要對(duì)土樣進(jìn)行充分稀釋（稀釋度足夠高時(shí)，能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落），然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上，也就是要采用稀釋涂布平板法，其操作如圖。（1）取樣與樣品梯度稀釋（2）涂布平板（3）培養(yǎng)與觀察待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板和一未涂布的平板倒置，放在30-37℃恒溫箱中培養(yǎng)1-2d。在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到單菌落。（三）微生物的數(shù)量測(cè)定1、稀釋涂布平板法的應(yīng)用2、稀釋涂布平板法的計(jì)數(shù)原理3、稀釋度確定的原則4、重復(fù)與對(duì)照5、計(jì)數(shù)的誤差6、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法1、稀釋涂布平板法的應(yīng)用稀釋涂布平板法除可以用于分離微生物外，也常用來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目，即分離和計(jì)數(shù)。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算公式每g樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)；

M代表稀釋倍數(shù)。2、稀釋涂布平板法的計(jì)數(shù)原理3、稀釋度確定的原則樣品的稀釋度將直接影響平板上的菌落數(shù)目。在實(shí)際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)（即設(shè)置一系列濃度梯度的稀釋液），以保證獲得菌落數(shù)為30～300、適于計(jì)數(shù)的平板。4、重復(fù)與對(duì)照在同一稀釋度下，應(yīng)至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值。重復(fù)對(duì)照對(duì)照有兩類，一類是空白的選擇培養(yǎng)基和空白的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與涂布的平板的對(duì)照，一類是涂布的選擇培養(yǎng)基和涂布的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的對(duì)照。5、計(jì)數(shù)的誤差統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少，這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。6、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法利用顯微鏡直接計(jì)數(shù)，也是一種常用的、快速直觀的測(cè)定微生物數(shù)量的方法。該方法利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，然后再計(jì)算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板常用于相對(duì)較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子等的計(jì)數(shù)。細(xì)菌計(jì)數(shù)板可對(duì)細(xì)菌等較小細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。（四）土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)1、實(shí)驗(yàn)原理2、選擇培養(yǎng)基的成分3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4、操作提示5、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)6、進(jìn)一步探究1、實(shí)驗(yàn)原理2、選擇培養(yǎng)基的成分組分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0gH2O定容至1000mL絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)細(xì)菌適宜再酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)分布在距地表3~8cm的土壤層。因此，取樣時(shí)一般要鏟去表層土，取距地表3~8cm的土壤層,將樣品裝入紙袋中。（1）土壤取樣一般選用1×104、1×105、1×106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。

在初次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，應(yīng)選擇一個(gè)比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。（2）樣品稀釋培養(yǎng)基配制的過程和酵母菌純培養(yǎng)過程中配制的過程一樣，不同的是，本實(shí)驗(yàn)要配制兩種培養(yǎng)基，一種是以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，一種是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照檢測(cè)選擇培養(yǎng)基是否起到選擇作用。涂布平板時(shí)每種稀釋濃度各涂布三個(gè)選擇培養(yǎng)基，一個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。（3）培養(yǎng)基配制與涂布平板（3）培養(yǎng)基配制與涂布平板每個(gè)濃度至少設(shè)置4個(gè)平板，1、2、3平板是選擇培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組，三個(gè)重復(fù)），4為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用）將涂布好的平板和一個(gè)未涂布的選擇培養(yǎng)基平板以及一個(gè)未涂布的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d。本實(shí)驗(yàn)中，我們可以每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。（4）微生物的培養(yǎng)與觀察4、操作提示（1）不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。（2）要按照前面學(xué)習(xí)過的無菌操作的方法進(jìn)行規(guī)范操作。取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。（3）本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管比較多，為避免混淆，最好在使用前要做好標(biāo)記。標(biāo)記要寫在培養(yǎng)皿底部外側(cè)。（4）本實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長，要事先規(guī)劃時(shí)間，以便提高工作效率，在操作時(shí)更加有條不紊5、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)如果沒有接種的培養(yǎng)基上沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。如果接種后的完全培養(yǎng)基上的菌落數(shù)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，說明選擇培養(yǎng)基篩選出了一些尿素分解菌。(1)結(jié)合對(duì)照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。如果得到了兩個(gè)或多個(gè)菌落數(shù)為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。(2)你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30~300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個(gè)平板的菌落數(shù)接近？如果是用同一土樣進(jìn)行的操作，數(shù)據(jù)應(yīng)該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基配制是否合理等方面查找原因。(3)你統(tǒng)計(jì)的每克土樣中能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學(xué)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果接近嗎？如果差異很大,可能是什么原因引起的？6、進(jìn)一步探究細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，因此可以通過檢測(cè)培養(yǎng)基pH的變化來判斷是否發(fā)生了該化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而判斷該菌是否為尿素分解細(xì)菌。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅：（1）液體培養(yǎng)基可以直