第二節(jié)基因工程的基本操作程序1997年，我國政府首次批準商業(yè)化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經濟效益450億元。你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？轉基因抗蟲棉非轉基因抗蟲棉培育轉基因抗蟲棉的步驟1目的基因的篩選與獲取2基因表達載體的構建3將目的基因導入受體細胞4目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的篩選與獲取1、目的基因的概念及其種類2、篩選合適的目的基因3、利用PCR獲取和擴增目的基因1、目的基因的概念及其種類概念在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等相關的基因就是目的基因。種類根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質的基因。如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質、生產藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關的基因。1、目的基因的概念及其種類蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W家將“殺蟲基因”轉入棉花中，讓棉花產生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。這個“殺蟲基因”就是培育轉基因抗蟲棉用到的目的基因——Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因。2、篩選合適的目的基因從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選，是較為有效的方法之一。例如，對Bt基因及其表達產物有了較深入了解之后才使之成為目的基因。篩選方法認識基因結構和功能的技術方法測序技術的發(fā)展；以及序列數(shù)據(jù)庫、序列比對工具等的應用為科學家找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能。相關信息當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體。因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生上述影響。3、利用PCR獲取和擴增目的基因（1）目的基因的獲取方法（2）PCR的概念（3）PCR的條件（4）PCR的過程（1）目的基因的獲取方法目的基因的獲取方法有人工合成法、PCR擴增法、基因文庫法等?，F(xiàn)在，常用PCR特異性地快速擴增目的基因。（2）PCR的概念PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學獎。PCR之歌（3）PCR的條件參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶（體外用高溫代替）4種脫氧核苷酸DNA母鏈DNA聚合酶引物打開DNA雙鏈作為合成DNA子鏈的原料作為DNA復制的模板催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3‘端開始連接脫氧核苷酸①DNA復制所需的基本條件（3）PCR的條件②PCR所需的基本條件耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸(dNMP)通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行，PCR過程一般在PCR儀中進行。PCR儀可以自動改變溫度完成擴增。相關信息真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反應緩沖液中一般要添加Mg2+。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。不同引物的堿基排列順序不同，因此引物具有多樣性和特異性；PCR擴增的特異性由引物的特異性決定。（4）PCR的過程DNA模板4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶引物5'3'3'5'5'3'3'5'3'5'5'3'5'3'5'3'5'3'3'5'變性

當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。復性

當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。延伸

當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。循環(huán)（4）PCR的過程3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'第一輪循環(huán)的產物作為第二輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第二輪循環(huán)的產物。第二輪循環(huán)的產物作為第三輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第三輪循環(huán)的產物。5'3'3'5'3'5'3'5'PCR每次循環(huán)一般分為變性、復性和延伸三步。每次延伸后的產物又可以作為下一個循環(huán)的模板，因此每循環(huán)一次目的基因的數(shù)量可以增加一次，即指成數(shù)形式擴增約為2n，其中n為循環(huán)次數(shù)，擴增n次共需要（2n+1-2）個引物。如果首次擴增的模板DNA比目的基因長，那么擴增n次后，目的基因的數(shù)量為（2n-2n）個，即從第三次擴增才開始出現(xiàn)目的基因。mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄成cDNA（互補DNA）再進行擴增。由mRNA逆轉錄形成cDNA的過程是：第一步，逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；第三步，單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA。旁欄思考用PCR可以擴增mRNA嗎？？總結一下cDNA的概念。1、構建基因表達載體的目的2、基因表達載體的組成3、構建的方法二、基因表達載體的構建1、構建基因表達載體的目的讓目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2、基因表達載體的組成基因表達載體的構建這一步是基因工程的核心?；虮磉_載體是載體的一種，包括目的基因、標記基因、啟動子、終止子等。2、基因表達載體的組成（1）目的基因：指外源DNA分子的有效片段。（2）啟動子：啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉錄的起始位點，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能夠驅動基因轉錄出mRNA，最終表達出人類所需的蛋白質。（3）終止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列結構的DNA片段，是轉錄過程終止的信號。（4）標記基因的作用：用于鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，如抗生素抗性基因就可以作為標記基因。3、構建的方法重組DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因DNA連接酶基因表達載體構建模式圖限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標記基因復制原點質粒同種限制酶或能產生相同末端的限制酶？旁欄思考將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？有人采用總DNA注射法進行遺傳轉化，即將一個生物的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體植物，沒有進行基因表達載體的構建。這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因導入了受體植物。

同一種限制酶切割獲得的目的基因和載體混合后加DNA連接酶會出現(xiàn)的連接方式有（僅考慮兩兩連接）：自連片段間兩兩連接目的基因自身環(huán)化載體自身環(huán)