第3章

基因工程第1節重組DNA技術的基本工具新課程標準核心素養1.簡述重組DNA技術所需的三種基本工具及其作用。2.認同基因工程的誕生和發展離不開理論研究和技術創新。3.進行DNA的粗提取與鑒定。1.科學思維——模擬重組DNA分子的操作過程，說出合成新DNA分子的基本原理。2.社會責任——關注基因工程的社會議題，參與討論基礎理論和技術發展如何催生了基因工程。1．基因工程的誕生和發展(1)基因工程的誕生①1944年，艾弗里等人通過肺炎鏈球菌轉化實驗證明了遺傳物質是________，還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉移。②1953年，沃森和克里克建立了___________________模型并提出了遺傳物質自我復制的假說。③1961年，尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的____________。④20世紀70年代初，多種限制酶、_____________酶和逆轉錄酶被相繼發現，為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創造了條件。⑤1973年，科學家證明__________可以作為基因工程的載體，構建____________，使外源基因在原核細胞中成功表達，并實現物種間的基因交流。DNADNA雙螺旋結構密碼子DNA連接質粒重組DNA一、基因工程的誕生與發展(2)基因工程的發展①1982年，第一個基因工程藥物___________________被批準上市。②1984年，我國科學家朱作言領導的團隊培育出世界上第一條

_______________。③1985年，穆里斯等人發明______，為獲取目的基因提供了有效手段。④1990年，__________計劃啟動。2003年，該計劃的測序任務順利完成。⑤21世紀以來，科學家發明了多種_________________，可以實現低成本測定大量核酸序列，加速了人們對基因序列的了解。⑥2013年，華人科學家張鋒及其團隊首次報道利用最新的__________技術編輯了哺乳動物基因組。重組人胰島素轉基因魚PCR人類基因組高通量測序技術基因組編輯項目具體內容操作對象基因原理_________操作環境操作水平_________結果獲得_____________的新的生物類型和生物產品優點克服_______________的障礙;_________生物性狀基因重組分子水平符合人們需要遠緣雜交不親和定向改造2.基因工程的概念生物體外思考討論：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。想一想需要做哪些關鍵工作？普通棉花抗蟲棉？一、限制性核酸內切酶

——“分子手術刀”1、來源：主要從原核生物中分離純化出來

2、種類：現在已經從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內切酶(限制酶)。3、作用特點：具有專一性，表現在以下兩個方面4、作用部位:特定切點上的磷酸二酯鍵5'3'5'3'TAGGTATCCA磷酸二酯鍵①能夠識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。②能夠切割特定序列中的特定位點。5、兩種常用的限制酶：限制酶的命名是根據細菌種類而定，以EcoRI為例:

E：Escherichia(屬)

co：coli(種)

R：RY13(品系)

I：首先發現在此類細菌中發現的順序EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichiacoli）R型菌株中分離出的第一個限制酶；SmaⅠ：粘質沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一個限制酶。EcoRⅠ和SmaⅠ黏性末端黏性末端（1）EcoRI限制酶的切割:被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。中軸線（2）SmaI限制酶的作用只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。在C和G之間切開6、結果：產生黏性末端或平末端思考討論1：仔細觀察以下四種限制酶識別的特定序列有何特點？EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……TaqⅠ………T-C-G-A………………A-G-C-T………限制酶所識別的序列的特點是：呈現堿基互補對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，稱為回文序列。思考討論2：

原核生物很容易受到自然界中外源DNA的入侵，但是長期的進化過程中，這些原核生物卻沒有因為外源DNA的入侵而滅絕。你推測這其中的原因是？

原核生物細胞中的限制酶會將外源DNA切割掉，使之失效，以保證自身的安全，但是不會切割自身的DNA，這是原核生物在長期進化過程中形成的一套防御機制。……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因練習：使用EcoRI剪切目的基因1.要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性(平)末端？要切兩個切口，產生四個黏性(平)末端。2.如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考討論3：G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同種限制酶切割(EcoRⅠ)3.把兩種來源不同的DNA進行重組，應該怎樣處理？

缺口怎么辦？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G二、DNA連接酶——分子縫合針1.作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，2.種類：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶ATAGTCCGAATT連接兩個DNA片段3.與DNA聚合酶區別：CAATTDNA聚合酶GAGTATCDNA聚合酶連接單個脫氧核苷酸形成單鏈DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵3.與DNA聚合酶區別：根據所學知識，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵練習：質粒（最常用）將外源基因送入受體細胞。1.作用：動植物病毒λ噬菌體的衍生物2.種類：質粒三、基因進入細胞的載體——分子運輸車

質粒——裸露的、結構簡單的、獨立于細菌擬核DNA之外，并具有自我復制能力的很小的雙鏈環狀DNA分子。3、運載體需具備的條件（1）能夠在宿主細胞中復制并穩定地保存（2）有一個至多個限制酶切點（3）有某些標記基因（4）對受體細胞無害、易分離能進入受體細胞并在受體細胞內復制并表達；便于與不同目的基因結合便于鑒定和篩選有標記基因的存在，可用含青霉素的培養基鑒別。有切割位點能復制并帶著插入的目的基因一起復制實際上自然存在的質粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。補：標記基因對重組DNA的鑒定和選擇原理標記基因通常有:①抗生素的抗性基因，如:抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環素基因(tetr)②熒光蛋白基因，如:綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)重組DNA導入受體細胞不是100%，而且導入率較低質粒的特點質粒是基因工程中最常用的運載體最常用的質粒是大腸桿菌的質粒細胞染色體外能自主復制的小型環狀DNA分子存在于許多細菌及酵母菌等生物中質粒的存在對宿主細胞無影響質粒的復制只能在宿主細胞內完成4、質粒的特點：真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…實例：重組DNA分子的模擬操作AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…GCCGTATG…【典例】圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因導入受體細胞的質粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關限制酶的作用部位如圖所示，現欲培養轉基因抗病植株，回答下列問題。（1）上述操作中不宜選用SmaI，原因是SmaI會破壞__________和_____________。（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，__________________________________________________。目的基因抗性基因目的基因只有一側含有黏性末端，不能插入到質粒中1、選目的基因兩端和運載體都有的酶切位點；2、所選酶切位點不能破壞目的基因以及標記基因。方法總結：---選擇酶切位點的原則(1)限制性內切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列()(2)DNA連接酶能將兩堿基間通過氫鍵連接起來(

)(3)E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(

)(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同(

)(5)質粒是雙鏈環狀DNA分子，是基因工程常用的載體。()××××√【基礎過關】【典例1】如表為常用的限制酶及其識別序列和切割位點，據表分析以下說法正確的是(

)限制酶BamHⅠEcoRⅠHindⅡ識別序列和切割位點G↓GATCCG↓AATTCGTY↓RAC限制酶KpnⅠSau3AⅠSmaⅠ識別序列和切割位點GGTAC↓C↓GATCCCC↓GGG(注：Y表示C或T，R表示A或G)DA.一種限制酶只能識別一種脫氧核苷酸序列B.限制酶的切割位點一定位于識別序列的內部C.不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D.限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端【典例2】下列關于質粒的敘述，正確的是（）A.質粒是廣泛存在于細菌細胞中的一種顆粒狀細胞器B.質粒是細菌細胞質中能自主復制的小型環狀DNA分子C.質粒只有在侵入宿主細胞后在宿主細胞內復制D.細菌質粒的復制過程一定是在宿主細胞外獨立進行E.質粒是基因工程中唯一的運載體B【典例3】用限制酶EcoRⅤ單獨切割某質粒，可產生1個14kb(1kb即1000個堿基對)的長鏈，而同時用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ聯合切割該質粒，可得到三種長度的DNA片段，見下圖(其中*表示EcoRⅤ切割后的一個黏性末端)。若用MboⅠ單獨切割該質粒，則產生的DNA片段的長度為(

)A.2.5kb和5.5kb B.2.5kb和6kbC.5.5kb和8kb D.6kb和8kbD限制酶DNA連接酶載體①對受體細胞無害；②有一個至多個限制酶切割位點；③有特殊的標記基因；④能自我復制或能整合到宿主DNA上。質粒、λ噬菌體衍生物

、動植物病毒基因工程的