15I本文件主要起草人：王萍、龍建國、劉杰才、陳貴華、蘇1為葉片斑駁花葉，葉肉淺綠，葉脈深綠；嚴重時呈現葉片皺縮，葉肉退化，蕨葉等24.2.110mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液：在160mL水中加入80.0g氫氧化鈉，溶解后，冷卻至室溫，4.2.20.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)溶液(pH8.0):稱取18.6g乙二胺四乙酸二鈉，加入70mL水中，緩慢滴加氫氧化鈉溶液(見4.3)直至EDTA-Na2完全溶解，用氫氧化鈉溶液(見4.3)調pH至8.0加水定容至100mL。在121℃條件下滅菌20min。4.2.31mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCL)溶液(pH8.0):稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷溶解于800mL水中，用鹽酸調pH至8.0加水定容至1000mL。在121℃條件下滅菌20min。4.2.4TE緩沖液(pH8.0):分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液(見4.5)和2mL乙二胺四乙酸二鈉溶液(見4.4),加水定容至1000mL。在121℃條件下滅菌20min。4.2.550×TAE緩沖液：稱取242.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris),先用500mL水加熱攪拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二鈉溶液(見4.4),用冰乙酸調pH至8.0,然后加水定容至1000mL。使用時4.2.6加樣緩沖液：稱取250.0mg溴酚藍，加入10mL水，在室溫下溶解12h;稱取250.0mg二甲基苯腈藍，加10mL水溶解；稱取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上3種溶液，加水定容至100mL,在4℃下保存。4.2.10引物溶液：用TE緩沖液(見4.6)將上述引物稀釋到10μmol/L。3中，進行檢測分析。如需長期保存可置于-80℃冰箱中。樣品應避免交叉污染。8.2.1RNA提取：將樣品在液氮下研磨至粉狀后稱取0.1g,置于滅菌2mL離心管中，加入1mLTRIzol比值為1.8～2.0時，可用于RT-PCR檢測。電泳結束后，觀察結果(參見附錄B.1)。如果總RNA條帶清楚，就可以用于后續實驗。輕輕混勻，42℃孵育30min。85℃加熱5sec終止反應，-20℃冰箱保存備用。8.4.1在PCR管中按表1依次加入反應試劑，混勻。8.4.2將PCR管放入離心機中，瞬時離心2sec,取出PCR管，放入PCR儀中。8.4.3PCR反應程序：94℃預變性3min;94℃變性30sec,退火30sec(CMV58℃,WMV50℃,ZYMV50℃),72℃延伸1min,35個循環；72℃延伸10min,4℃保存。48.5.2電泳結束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀上成像，進行結果分析。測。當結果有效時，試樣檢測出目標條帶判定為病5(資料性)籽用西葫蘆葉片CMV/WMV/ZYMV特異性片段序列A.1CMV特異性片段序列1TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCGCATTCAAATTCGAGTTAAT50GAAATTTGATTCTACCGTGTGGGTG100TCGGACCTGTCCGTCGCCGCCATCTCTGCTATGTTTGCGGAC150ACCGGTACTGGTTTATCAGTATGCTGCATCCGGAGTCCAAGCCAACAATA200AATTGTTGTATGATCTTTCGGCGATGCGCGCTGATAT250AAGTACGCCGTTCTCGTGTATTCAAAAGACGATGCTCT300GTTAGTACTTCATGTCGACATA.2WMV特異性片段序列1CCAGTGGCAAAGGTGATAAGCCACAAAACCTGCAAACTGGGCAGGG50CAAGGAACCAACAAAAGCTGGCACAGTCAGCAAAGATGTGAACGTTGGAT150CTTCCAACAGTTGGT200ATACAAGCCTAATCAAGTTGATTTGTTTAACACTCGAGC400AGCAAGTTGAGTACCCACTAAAGCCAATTGTTGAAAATGCAAAGCCAACT450TTGAGACAAATCATGCATCAA.3ZYMV特異性片段序列1ATGCAGAGGCACCATACATGCCGAG99AAAACTCCTGAAAGAGCCCGCGAAGCTGTTGCGCAGATGAAAGCAGCA147GCTCTTAGCAATGTT197CACCACTAGCGAAGA245AACATGCACACCTTGTTAGGTGTGAACACAATGCAGTA6(資料性)籽用西葫蘆葉片CMV/WMV/ZYMV的RT-PCR檢測電泳圖B.1籽用西葫蘆葉片總RNA電泳圖譜見圖B.1。B.2籽用西葫蘆葉片病毒RT-PCR檢測電泳圖見圖B.2。MMM—485bpNC2NCl423142317250bp