DBXX

陜西省市地方標準

DBXX/TXXX-20xx

獅猴桃無病毒種苗生產技術規程

Technicalcodefortheproductionofvirus-freekiwifruitstock

（征求意見稿）

20xx-xx-xx發布20xx-xx-xx實施

陜西省市場監督管理局發布

前言

本標準依據GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則

》起草。

本標準由陜西省農業農村廳提出并歸口。

本標準起草單位：西北農林科技大學、楊凌夢綠生態農業有限責任公司。

本規程起草人：劉占德，張阿玲，史遐，劉艷飛，賀浩浩，高志雄。

本標準為首次發布。

1適用范圍

本標準規定了林猴桃病毒脫除方法、病毒檢測方法、脫毒種苗保存與繁殖。

本標準適用于搟猴桃脫毒種苗繁育及狒猴桃病毒檢測。

2術語和定義

下列術語和定義適用于本標準。

2.1莖尖培養脫毒Viruseliminationbyshoottipculiure

切取0.2~0.5mm帶毒試管苗莖尖，經組織培養獲得無病毒植株的過程。

2.2莖尖超低溫療法脫毒Viruseliminationbyshoottipcryotherapy

切取l.0~2.0mm帶毒試管苗莖尖，經液氮處理后進行組織培養獲得無病毒植株的過程。

2.3熱療法結合莖尖培養脫毒Viruseliminationbyihermotherapycombinedwithshoottip

culture

先對帶毒試管苗進行熱處理，熱處理結束后取莖尖進行莖尖培養獲得無病毒植株的過

程。

2.4化療法結合莖尖培養脫毒Viruseliminationbychemotherapycombinedwithshoottip

culture

先將帶毒試管苗置于含抗病毒藥物的培養基中培養，培養結束后取莖尖進行莖尖培養

獲得無病毒植株的過程。

2.5熱療法結合莖尖超低溫療法脫毒Viruseliminationbytherniotherapycombinedwithshoot

tipcryotherapy

先對帶毒試管苗進行熱處理，熱處理結束后取莖尖進行超低溫處理，最后經組織培養

獲得無病毒植株的過程。

2.6化療法結合莖尖超低溫療法脫毒Viruseliminationbychemotherapycombinedwithshoot

lipcryotherapy

先將帶毒試管苗置于含抗病毒藥物的培養基中培養，培養結束后取莖尖進行超低溫處

理，最后經組織培養獲得無病毒植株的過程。

2.7化療法結合熱療法和莖尖培養脫毒Viruseliminationbychemotherapycombined

withtherniotherapyandshoottipculture

先將帶毒試管苗置于含抗病毒藥物的培養基中培養，之后進行熱處理，熱處理結束后

取莖尖進行組織培養獲得無病毒植株的過程。

2.8熱療法結合化療法和莖尖超低溫療法脫毒Viruseliminalionbyihennotherapycombined

withchemotherapyandshootlipcryoihcrapy

先將帶毒試管苗置于含抗病毒藥物的培養基中培養，之后進行熱處理，熱處理結束后

再取莖尖進行超低溫處理，最后經組織培養獲得無病毒植株的過程。

2.9無病毒母株virus-freemotherplant

通過病毒脫除處理或直接篩選獲得的、經檢測并確認不攜帶本文件規定的病毒的植株。

2.10無病毒苗木virusfreeseedling

未攜帶有本文件規定的病毒的猿猴桃苗木。

2.11無病毒母本園virus-freemotherblock

用于提供猾猴桃無病毒母株保存的闞地。

3脫毒原理

病毒在植物體內分布不均勻，植物莖尖頂端分生組織中的病毒含量較低甚至不含病毒,

熱處埋及抗病毒約物處埋能夠抑制病毒RNA的合成，因此用通過莖尖培養，或結合熱療

及化療對植物病毒進行脫除：在莖尖超低溫療法脫除植物病毒中，莖尖經過冷凍保護處理

后轉入液氮中冷凍時，分化程度較低、核質比大、自由水含量較低的莖尖頂端分生組織和

幼嫩葉原基細胞更容易存活。由于很多病毒無法侵入莖尖頂端分生組織，因此無病毒的頂

端分生組織可以在液氮冷凍后存活并再生為無病毒植株。

4病毒檢測與脫除

4.1病毒種類

病毒種類見表A.lo包括狒猴桃病毒A(ActinidiavirusA,AcVA)、舜猴桃病毒B

(ActinidiavirusB,AcVB)、物猴桃種傳潛隱病毒(Actinidiaseedbomelatentvirus,

ASbLV)>物猴桃黃化環斑病毒(.Actinidiayellowingringspotvirus,AYRSpV)、舜猴桃

病毒1{Actinidiavirus1,AcV-l)、梆猴桃黃化病毒1(.Actinidiayellowingvirus1,

AcYVl)、舜猴桃黃化病毒2(Aainidiayellowingvirus2,AcYV2)、蘋果莖溝病毒

(Applestemgroovingvirus.ASGV)、櫻桃卷葉病毒(CherrjLeafRollvirus*CLRV)、

天竺葵帶斑病毒(Pelargoniumzonatespotvirus?PZSV)、柑橘葉斑駁病毒(Citrusleaf

blotchvirus.CLBV)等。

4.2病毒檢測

采用RT-PCR的方法進行病毒檢測。具體參見附錄A。

4.3貓猴桃無病毒母株的獲取

4.3.1材料選擇

選擇品種純正、經觀察未發現病毒病癥狀且生長健壯、性狀優良的植株，參照4.2的

方法進行病毒檢測，確定不攜帶4.1規定的病毒的可作為無病毒母株：經檢測，確定植株

已感染4.1規定的病毒，則應進行脫毒處理，病毒脫除后培育的凍猴桃植株，經檢測為無

病毒的，也可作為無病毒母株。

4.3.2外植體的建立

選取健壯驕猴桃植株當年生新梢作為外植體，剪去葉片，用自來水和洗潔精溶液充分

清洗干凈。將枝條剪成長3~5cm的莖段，于超凈臺內用75%酒精表面消毒10~305,再用

1%的次氯酸鈉溶液消毒570min,最后用無菌水沖洗4~5次。將消毒后的外植體切成長

1.5cm的帶芽莖段，用無菌濾紙吸干其表面的水分后，接種至初分化培養基中，誘導莖段

腋芽萌發。4周后萌發的腋芽切下，置于增殖培養基中進行繼代培養，每4?6周繼代一次。

培養溫度24"C±2℃,光照強度3(XX)lx,光照時間16h/d。

4.3.3病毒的脫除

4.33.1莖尖培養脫毒

以4~6周苗齡的凍猴桃帶毒試管苗為材料，于超凈工作臺中在體式顯微鏡下切取

0.2~0.5mm的莖尖，將其轉接至含增殖培養基的培養皿中培養，每4周繼代一次。當莖尖

長成小植株時轉至含增殖培養基的組培瓶中繼續培養。

433.2莖尖超低溫療法脫毒

以4~6周苗齡的驕猴桃帶毒試管苗為材料，于超凈工作臺中在體式顯微鏡下切取

l.0~2.0mm的莖尖。先將莖尖置于0.25M蔗糖溶液中預培養24h；后轉置于0.5M蔗糖溶

液中預培養24h；預培養結束后，將莖尖轉置于加我液中室溫下處理20min；加我完成后,

符莖尖轉置于提前預冷的玻璃化冷凍保護液PVS2中冰上處理20?60min。PVS2處理結束

前兩分鐘，將莖尖轉移至滅菌鋁箔條上的PVS2液滴中，后將鋁箔條置于液氮中處理1h?

液氮處理完畢后將帶有莖尖的鋁箔條從液氮中取出，迅速放入卸載液中解凍20min：卸載

完成后,將莖尖轉置至恢兔培養基中,先于24±2℃的溫度條件下黑暗培養"1?后轉入正

常光照F培養，每4周繼代一次。莖尖超低溫療法脫除源猴桃病毒所用溶液配方參見附錄

B,脫毒流程參見附錄C。

4.333熱療法結合莖尖培養脫毒

以4~6周苗齡的凍猴桃帶毒試管苗為材料，切取約2cm大小的莖段先于正常條件下培

2周,后轉至熱處理箱(溫度：30℃~40℃：光照強度：3000lx：光照時間：16h/d).熱

處理的方式主要有三種：對于耐熱品種，可采用恒溫處理；中等耐熱品種及熱敏感品種則

可采用變溫處理或逐步升溫處理。處理時間為2~4周。熱處理結束后切取0.2~0.5mm莖尖

進行莖尖培養，方法同4.3.3.1。

43.3.4化療法結合莖尖培養脫毒

以4~6周苗齡的獅猴桃帶毒試管苗為材料，取約2cm大小的莖段置于含15-100rng/L

利巴韋林的培養基中培養4~6周，后取5mm莖尖進行莖尖培養，方法同433.1。

43.3.5熱療法結合莖尖超低溫療法脫毒

以4-6周苗齡的蛛猴桃帶毒試管苗為材料，取約2cm大小的莖段先進行熱處理，方法

同433.3。熱療結束后切取1.0?2.0mm大小的莖尖進行超低溫處理，方法同4.332。

43.3.6化療法結合莖尖超低溫療法脫毒

以4~6周苗齡的舜猴桃帶毒試管苗為材料，切取約2cm大小的莖段進行化療，方法同

433.4。化療結束后切取1.0~2.0mm大小的莖尖講行貂低溫處理，方法同4.332。

4.337化療法結合熱療法和莖尖培養脫毒

以4~6周苗齡的梆猴桃帶毒試管苗為材料，切取約2cm大小的莖段接種至含15-100

mg/L利巴韋林的培養基中先于正常條件下培養2周，之后將其轉至熱處理箱繼續培養2?4

周,熱療和化療方法同4.333和4.3.3.4。熱療和化療結束后取0.2~0.5mm莖尖進行莖尖培

養，方法同4.3.3.1。

4.338熱療法結合化療法和莖尖超低溫療法脫毒

以4-6周苗齡的掰猴桃帶得試管苗為材料，取約2cm大小的莖段先進行熱療和化療，

方法同4.337。熱療和化療結束后取1.0~2.0mm大小的莖尖進行超低溫處理，方法同

433.2。

4.4病毒脫除后莖尖再生與病毒檢測

經脫毒處理的莖尖培養2個月后，出現明顯的莖段伸長(>5mm)并再生出2~3片新

葉時視為再生，隨后將再生莖尖轉接到增殖培養基上繼續培養，大約培養I個月后，脫毒

處理再生苗出現分株,此時將來源于同一個莖尖的植株轉至同一個組培瓶中并編號.繼代

培養4~6周后取樣進行第一次病毒檢測。將檢測結果為陰性的植株繼續繼代培養4-6周后

取樣進行第二次病毒檢測，將兩次檢測結果均為陰性的試管苗初步定為脫毒苗。此后，每

4~6周繼代一次脫毒苗。

4.5生根培養

以不帶病毒的增殖苗為材料，切取約2cm大小的莖段轉接到生根培養基(1/2MS+

0.6mg^IBA,pH=5.8),在24±2C條件下，進行4周左右的生根培養。

4.6煉苗和移栽

從生根培養至幼根長至1cm左右時，將組培瓶移入日光溫室煉苗，遮陰3d不開瓶口,

擰松瓶口放置Id,將瓶口敞開2d,之后進行移栽，控制氣溫不超過30C,空氣相對濕度

在90%以上。

將經過煉苗的組培苗洗凈培養基，移栽至基質為珍珠巖：泥炭：細沙=1:1:1或發酵餅

肥：土壤：基質1:1:1并用多菌靈消毒晾干后的營養缽(口徑x高為16cmx16cm),澆透

水，置于覆蓋60目防蟲網的溫網室內，在營養缽上覆蓋塑料薄膜，期間及時噴水以保持莖

葉濕潤，15d后揭去薄膜。

4.7無病毒苗移栽后病毒復檢

脫毒苗移栽半年后進行病毒更檢，若復檢結果為陰性，則可認定為脫毒苗：若匏檢結

果為陽性，則該再生苗不是脫毒苗，需進行進一步的脫毒處理。此后每年至少做一次病毒

復檢，以防病毒再次感染。

5無病毒母本園的建立

5.1圃地準備

圃地所在區域應為非驕猴桃潰瘍病發生區與掰猴桃適栽區。選擇疏松肥沃、排水良好、

微酸性的砂質壤土，且5年內未栽植過果樹的地塊。

5.2無病毒母株的栽植

經檢測確定不攜帶4.1規定的掰猴桃病毒，或經4.3殊猴桃病毒脫除的植株可作為無病毒

母株按株行距為3mx4m定植在網室中。調查、分析并記錄每單株的園藝學性狀，待顯示

固有的園藝學性狀后，選做母本樹，提供無病毒接穗。

5.3無病毒母本園的管理

無病毒母本園常用工具須專用，枝剪、刀、鋸子等在操作每個植株之前均需用75%的

酒精消毒。此外，工作人員進出園圃也應消毒，并嚴格執行其池人員進出登記、安全檢疫

制度。

每月定期觀察周內掰猴桃無病毒母株是否有病毒病癥狀，每年春梢萌發后10d進行病毒

檢測，經檢測，淘汰不符合2.10定義的植株。

6無病毒苗木的繁育

6.1苗圃準備

選擇疏松肥沃、排灌水方便、光照良好、冬春季無霜凍的地塊作為苗圃地；冬春季有

霜凍的區域，在溫室大棚建立苗圃。

6.2砧木準備

選擇生長健康、無病蟲害的，參照4.2的方法檢測后不攜帶病毒或脫毒后莖粗達0.6

cm以上的舜猴桃砧木苗，嫁接前砧木苗摘心，并去除基部萌薇。

6.3接穗采集

取生長健壯、芽體飽滿、無病害的當年生木質化的舜猴桃無病毒母株枝條，掛牌標記

母株編號。冬季剪下的接穗，應立即放在陰涼處，用2%濕沙埋藏備用。

6.4嫁接

春、夏嫁接多采用單芽枝接，也可采用單芽枝腹接法或帶木質芽接。

6.5嫁接后管理

6.5.1剪砧及抹除砧槃

嫁接后砧木接口下萌發的不定芽及時剪除.接芽失敗或風折不能再萌發的.應在砧木

是選留一個枝條，以備后期補接。采用單芽枝腹接法或帶木質部芽接法的嫁接苗成活后應

立即剪砧，剪口離接芽3?4cm,砧木上萌麋應及時抹除。。

6.5.2解綁

接穗嫁接部位完全愈合，新梢半木質化以后及時解去嫁接時的綁扎帶。為防止風劈促

進接口愈合牢固，扎帶自上而下分兩次解除，每次一半，間隔兩周。

6.5.3立支柱及摘心

當接芽K到20cm時，在嫁接苗的旁邊插竹竿作立柱，引縛護苗防風劈，綁縛時使用

“oc”字形活結。新梢拉直吊端向上生長，不要纏繞生長。

6.5.4土、水、肥管理

經常保持育苗地土壤濕潤，土壤相對濕度在70%~80%之間。有積水時要及時排出,

及時中耕除草，根據苗木長勢進行葉面噴肥或結合中耕除草、澆水等進行追肥，用尿素或

磷酸二氫鉀進行葉面施肥，濃度不得超過0.3%,土壤追肥每667m?每次施入尿素或磷酸二

氫鉀7.5~10kg,9月中旬停止施肥，促進苗木木質化。

6.5.5摘心

在幼苗生長6~8片葉50-50cm時，應及時摘心，以促進組織充實苗木粗壯。

7無病毒苗木出圃

苗木出圃前，定期觀察狒猴桃苗木形態特征，剔除有病毒病癥狀的植株。病毒脫除的

凍猴桃苗木出圃前，每批次應進行1次病毒檢測，按照GB/T2828.10規定的方法進行抽檢。

若檢測出攜帶病毒，應根據標記，追蹤其母株并進行病毒檢泱!。若母株也攜帶病毒，則立

即清除該母株及其周邊臨近的植株；若母樹不帶病毒，則立即清除攜帶病毒的苗木及其周

邊臨近植株。無病毒苗木出圃應滿足表1所規定的質量要求。

表I驕猴桃無病毒苗木質量

級別

項目

一級二級三級

品種與砧木純正。實生苗和嫁接苗砧木應以抗性強的

品種與砧木

美味、對萼、大籽物猴桃為主。

側根形態側根沒有缺失和劈裂傷

側根分布均勻、舒展而不卷曲

根側根數量(條)>4

側根長度(cm)當4B生苗N20.0,二年生苗230.0

側根粗度(cm)>0.5>0.4>0,3

直曲度(cm)<15.0

高度(cm)>60>50>40

粗度(cm)>1.0>0.8>0.6

苗

實生苗，飽滿芽數

干>5>4>3

(個)

嫁接苗品種部位，飽滿

>5>4>3

芽數(個)

皮層鮮活有光澤，無干縮皺皮，無新損傷，老損傷處

根皮與莖皮

總面積不超過1.0cm?

愈合良好。枝接要求接口部位砧穗粗細一致，沒有大

腳(砧木粗、接穗細)、小腳(砧木細、接硬粗)或

接合部愈合情況

嫁接部位四起臃腫現象：芽接要求接口愈合完整，沒

有空、翹現象。

木質化程度完全木質化

無根結線蟲、無蛤殼蟲、無潰瘍病、無疫霉病、無根

病蟲害

腐、無飛虱、無蛾類等。無國家規定的檢疫對象。

病毒檢測不攜帶4.1規定的病毒種類

8無病毒苗木的標識與包裝

8.1標識

搟猴桃無病毒母株標簽應包括品種、母株編號、病毒檢測單位、母株培育單位等信息。

舜猴桃無病毒苗木標簽應包括品種、等級、株數、病毒檢測單位、生產單位、地址等信息。

8.2包裝

搟猴桃無病毒苗木應按照品種和等級分別包裝。包裝內外應附有苗木標簽。

附錄A

(資料性附錄)

貓猴桃病毒檢測方法(RT-PCR法)

A.1適用范圍

本附錄提供的RT-PCR法適用于己知核酸序列的物猴桃病毒的檢測。

A.2儀器設備

恒溫水浴鍋；渦旋儀：高速冷凍離心機；-20C冰箱：超微量分光光度計；PCR儀：

電泳儀：凝膠成像儀。

A.3試劑

CTAB裂解液、隹磕基乙醇、液氮、氯仿、異戊醉、氯化鋰、無水乙醇、RNase-free水、

反轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒、核酸染料、TAE緩沖液。

A.4操作步驟

A.4.1總RNA提取

(I)于1.5mL無酶離心管中加入600HLeTAB裂解液和40蟹伊利基乙醇,65c預

熱；

(2)稱取0.1g待檢植株葉片樣品于液氮中迅速研磨至粉末狀，將粉末轉至a中的離

心管，渦旋混勻30s,65'C水溶10min,期間顛倒混勻2-3次：

(3)加入等體積的氯仿異戊醇混合液(V:V=24:1),顛倒混勻，4C條件下，11000

rpm離心10min：

(4)取500池上清液，加入等體枳的氯仿異戊醇混合液(V:V=24:l),顛倒混勻，4*C

條件下，11000rpm離心10min：

(5)取400RL上清液,加入二分之一體積的氯化液溶液(6M),顛倒混勻，-20°C

沉淀2-3h：

(6)4℃條件下，12000rpm離心10min,棄上清；

(7)加入500HL75%乙醇洗滌沉淀，4c條件下，12000rpm短暫離心30s,棄上清。

(8)加入500nL無水乙醇洗滌沉淀，4℃條件下，12000rpm短暫離心30s,棄上清

并吸除殘留液體，后將離心管倒扣晾干5min。

(9)加入3()pLRNase-free水溶解沉淀，檢測所提取總RNA的濃度、純度及完整性。

若總RNA質量合格，則立即進行cDNA合成或置于-80C超低溫冰箱保存備用；若總

RNA質量不合格，則需重新提取。

A.4.2cDNA合成

按照反轉錄試劑盒說明書進行操作。

A.4.3PCR擴增

A.4.3.1PCR反應體系

PCR反應液組成為：12.5piL2xTaqMix,IgLcDNA模板,上下游引物（lO^M）各1

卜（，無菌蒸譚水補足至終體積25pL。目標病毒對應的特異性檢測引物及擴增產物大小見

表A.1。

A.4.3.2PCR反應程序

PCR擴增程序為：94℃預變性5min：94c變性30s,54c退火30s,72c延伸15-

40s,循環35次;72c終延伸5min。

A.4.4PCR產物檢測

制備1%瓊脂糖凝膠，對PCR產物進行電泳檢測。電泳結束后，將瓊脂糖凝膠置于凝

膠成像儀中成像，并拍照記錄。

A.4.5檢測結果分析

（1）當檢測樣品中出現目標條帶.陰性對照和空白對照未出現目標條帶時,視為陽性.

即檢測樣品中攜帶相應病毒。

（2）當檢測樣品中未出現目標條帶，陰性對照和空白對照也未出現目標條帶時，視為

陰性，即檢測樣品中不攜帶相應病毒。

（3）當陰性對照或空白對照出現目標條帶時，無論檢測樣品中是否出現目標條帶，檢

測結果均視為無效，應重新檢測。

表A.1狒猴桃病毒檢測引物序列及擴增產物大小

病毒名稱引物序列(5VF)產物大小(bp)

都猴桃病毒AF:CATGGCAAAGAATATCTCAAG471

(AcVA)R:AGATCCAACCCAGAGTTGAAA

梆猴桃病毒BF:GTTTGCGAGGAGACGTAGGGC342

(AcVB)R:AGTTAAGTGCTCTYGGRGGTGTG

魅猴桃病毒CF:AAAGAACCCTACCTCCACC1106

(AcVC)R:CCATCTATATCTCAACAGCCTGCTCG

疥猴桃病毒DF:AGGACACTCAAGCCTCAACATC847

(AcVD)R:TTGTAGGCGACCCACAGAAG

獅猴桃褪綠環斑病毒F:ATCCAAGAATTCCTTAACAGCA477

(AcCRaV)R:TGTGCAATCATGGCTTATCAGA

麻猴桃黃化病毒1F:CAACGCCGCAAACATCCTTAT624

(AcYVl)R:CACCTGCTTCTCACAAACAGTCTCA

掰猴桃黃化病毒2F:AAAACAACTCAACAGAAACGCACTA530

(AcYV2)RTTCCCTGAAGTAGACAGAATAGACG

梆猴桃黃化環斑病毒F:TrrGGACTGGGAACGTAGAGG337

(AYRSpV)R:CGAGAAAGTGAGGTTATCGGG

舜猴桃種傳潛隱病毒F:GCDAARGCNGGNCARACHHTVGCBTGYTT363

(ASbLV)R:RAAYTCNCCNSWRAANCKCAT

掰猴桃病毒1F:AGGAATATTGGATCGGTTGTCG208

(AcV-1)R:GATGGTCAGTCTTAATCTCC

殊猴桃山樗病毒2F:CTGCTATACATCCTGAATGGT985

(AcEV-2)R:GATGTCTTTGTACTAGATGC

蘋果莖溝病毒F:CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC499

(ASGV)R:GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCC

柑橘葉斑駁病毒F:GAAAAGCAACGAAAGCAACCTA328

(CLBV)R:CGAACAAGATGTGATTCTCG

櫻桃卷葉病毒F:GTCGGAAAGATT/XCGTAAAAGG416

(CLRV)R:TGGCGACCGTGTAACGGCA

天竺葵輪斑病毒F:GATAAATTCAGAGCTCTCGG997

(PZSV)R:ATCTCTGCAGAITGTGTrCC

黃瓜花葉病毒F:GAGTCGTGCGTTTTCTTTGTGTTTT183

(CMV)R:AATGGCGAGGGTTTTyVTTGAGTC

馬鈴薯X病毒F:AGTGCGCGAGGTTTACCAATC790

(PVX)R:GTGGTTTGCCGCGAACGATTC

番茄壞死斑點相關病F:ATGATTTGTTTGGGGTTATG350

毒(TNSaV)R:GAATGGTTCTCCCTCTATGG

附錄B

（資料性附錄）

表B.1超低溫療法脫除麻猴桃病毒所用溶液配方

組分

溶液名稱

MS蔗糖丙三醇乙二醇二甲基亞碉

0.25M蔗糖溶液4.43g/L0.25M///

0.5M蔗糖溶液4.43g/L0.5M///

加載液4.43g/L0.4M2M//

PVS24.43g/L0.4M30%(w/v)15%(w/v)15%(w/v)

卸載液4.43g/L1.2M///

附錄c

（資料性附錄）

搐博目生

圖C.1莖尖超低溫療法脫除梆猴桃病毒流程圖

《貓猴桃無病毒種苗生產技術規程》

編制說明

一、工作概況

1.1任務來源

本標準是根據《陜西省市場監督管理局關于下達2022年陜西省地方標準制修訂

計劃項目的通知》要求起草,項目編號SDBXM111-2022。

1.2目的與意義

獅猴桃原產于中國，是一種營養價值極高的水果，有“VC之王”之稱，在全球

水果生產中占有重要位置。目前全球有30多個國家栽培掰猴桃，主產國有中國、意

大利、新西蘭和智利。截至2019年年底，全球栽培面積已達36.3萬公頃，產量達

430萬噸。其中我國的栽培規模最大，栽培面積29.1萬公頃，產量300.6萬噸，分別

占世界舜猴桃栽培面積和產量的80.2%和69.9%o陜西作為中國最大的舜猴桃產區，

栽培面積及產量分別占全國的30%和40%o

然而，近年米隨著舜猴桃栽培面積的不斷擴大，獅猴桃病毒病的擴散和蔓延也成

為威脅滁猴桃安全生產的隱患之一。目前，共鑒定出24種可侵染梆猴桃的病毒，包

括12種新病毒和12種已知的、狒猴桃是其新寄主的病毒，而在我國栽培掰猴桃中鑒

定出的病毒有17種。狒猴桃感染病毒后通常會表現出葉片花葉、斑駁、褪綠和畸形

等癥狀，嚴重時會引起樹干枯死、樹皮開裂、果實大小不均勻等癥狀，極大影響產量

和質量，造成嚴重經濟損失。有研究指出，狒猴桃病毒病在陜西不同地區，不同殊猴

桃種及品種上廣泛發生，且對陜西貓猴桃產量及品質造成了嚴重影響。

植物病毒是專性細胞內寄生物，只寄生在寄主的活細胞內，可通過營養繁殖世代

傳播，還可通過昆蟲媒介從受病毒感染的植物傳播到健康的植物，長期以來一直是農

業生產可持續發展的制約因素。掰猴桃常通過嫁接繁殖，因此導致了病毒在掰猴桃植

株上的積累和傳播。雖然化學藥品在控制病毒病方面有潛在的應用，但培育無病毒植

物才是有效控制它們的一種農業策略。目前.，世界各地廣泛種植無病毒植物，以控制

許多重要經濟作物的病毒性疾病，如塊莖作物、草本觀賞植物。從其他國家進口新品

種及國家或地區之間交換育種材料也都需要無病毒材料。此外，植物種質資源保存也

強調使用無病毒植物。因此，建立薄猴桃病毒脫除技術體系，制定“跺猴桃脫毒種苗

生產技術規程”具有重要的生產及經濟意義，為后續滁猴桃脫毒苗的生產提供理論基

礎和技術支持。

1.3主要工作過程

項目任務下達后，立即成立了梆猴桃無病毒種苗生產技術規程地方標準起草小組,

組織起草小組對測試標準的意義和總體技術要求進行學習，制定了本標準的工作方案、

技術路線、主要研究方法，標準的具體格式，確定了標準的總體框架和制定原則，明

確了標準制定的具體工作計劃和進度。起草小組通過多年自身試驗研究資料的整理，

結合對其他同行業無病毒種苗生產的數據資料的研究等方法，在總結起草單位多年來

徐猴桃無病毒種苗培育和實踐的基礎上，全面開展了該標準的制定工作。

1.4起草單位

標準由西北農林科技大學主導，楊凌夢綠生態農業有限責任公司協助起草。

二、標準編寫原則和研究內容

包括標準編制所遵循的原則，以及標準結構、要索、技術要求、關鍵指標的確定

依據和主要內容；地方標準修訂項目還應當列出和原標準主要差異情況。

本標準遵循適用性、先進性、統一性和協調性的原則，始終將經濟效益、生態效

益和社會效益有機結合，協調統一。

本標準共有8章，嚴格按照GB/T1.1-2020的規定編寫，本標準包括封面、引言、

名稱、適用范圍、術語和定義、要求等要素。主要內容包括標準的適用范圍、術語和

定義、脫毒原理、病毒檢測與脫除、無病毒母本園的建立、無病毒苗木的繁育、無病

毒苗木出圃及包裝標識等。

三、實證研究

本標準實施驗證工作開展了大量的試驗，尤其是對于滁猴桃病毒檢測與脫除方法

進行了系統的研究，確定了關鍵技術指標。

3.1化學療法脫毒處理利巴韋林濃度篩選

對感染AcVA、AcVB和AcCRaV三種病毒的大籽跳猴桃試管苗使用0、25、50、

75.lOOmg/L的利巴韋林增殖培養基上培養42d,對使用不同濃度利巴韋林進行處理

的試管苗生長狀況進行觀測并拍照記錄，結果如圖3-1所示，在處理的第14d,使用

25、50、75mg/L利巴書林處理植棟的生長情況一致與對照植株相似。在處理的28d,

筑著利巴韋林濃度的升高，植株生長變化明顯，利巴韋林濃度為5()mg/L時，植株長

勢最好，利巴韋林濃度為100mg/L時，植株部分葉片開始發黃，植株增殖受到輕微抑

制。處理結束時(42d),試管苗生長變化明顯，尤其在75、100mg/L利巴韋林濃度處

理下，植物病毒感染的癥狀均表現在葉片上，旦后者比前者癥狀更明顯，植株的增殖

受到了明顯的抑制作用。與對照相比，50mg/L利巴韋林濃度下植株的長勢最好。因

此，得出隨著利巴韋林濃度的加大，植株的生長先增強后減弱，在50mg/L的利巴韋

林濃度下長勢最好，所以后續脫毒試驗以25、50、75mg/L利巴韋林的濃度進行處理。

圖3-1利巴韋林化療后14、28和42天的離體大籽舜猴桃植株的生長情況

Fig.3-1GrowthofinvitroActinidiamacrospermaplantsafterchemotherapytreatmentswithribavirinfor

14.28.and42days

對照:離體大籽掰猴桃植株在標準生長室內培養;R25、R50、R75和R100:離體大籽搟猴桃植株在生

長室中培養在添加利巴韋林的增殖培養基上，濃度分別為25、50、75.lOOmg/Lo

CK：InvitroActinidiamacrospenmplantswereculturedinastandardgrowthroom;R2,R50andR75in

vitroActinidiamacrospermaplantswerecukurcdinagrowthroomonMSmediumsupplementedwith

ribavirinat25,50and75mg/L,respectively

3.2基于化學療法的脫毒處理對帶毒試管苗營養生長和增殖的影響

3.2.1化學療法脫毒處理對試管苗營養生長和增殖的影響

將帶毒大籽試管苗外施0、25、50、75mg/L利巴韋林在增殖培養基上培養6周

后，測量不同濃度利巴韋林處理時大籽駢猴桃試管苗營養生長和增殖。營養生長統計

結果如表3-1所示，在使用4個濃度利巴韋林對植株進行脫毒處理時，植株在節間數、

葉長、葉寬指標上沒有出現顯著性差異，但是50mg/L的利巴韋林處理對植株的株高、

鮮重以及葉片數產生了顯著影響。高濃度利巴韋林(50mg/L)處理產生了20.4個葉

片，顯著高于對照組的14.4個葉片，旦在株高上達到了23.26mm,顯著高于對照組的

15.74mm,高于25、75mg/L處理下的植株表現但不顯著；節間長達到了最長的

4.38mm,顯著高于對照組和使用75mg/L的利巴韋林處理植株；節間數高于其他處理

但不顯著；鮮重、干重及干重均顯著高于對照處理；僅有葉寬葉長出現了低于其他處

理的現象。

不同脫毒處理對“大籽”獅猴桃試管苗增殖結果的影響統計結果如圖3-2所示，

使用50mg/L的利巴韋林處理對植株的增殖數產生了顯著影響，高濃度利巴韋林

(50mg/L)處理可以增殖5.4個植株，顯著高于對照組和使用R25、75mg/L的處理的

3、3.8、3.6個植株。所以，在正常處理6周的條件下，隨著利巴韋林濃度的上升，

50mg/L利巴韋林處理下大籽林猴桃植株綜合生長指標最好，與處理6周時植株的生長

情況一致。

3.2.2化學療法結合熱處理對試管苗營養生長和增殖的影響

將帶毒大籽試管苗外施0、25、5()、75mg/L利巴韋林在增殖培養基上培養2周，

然后再經過4周的熱處理后均可以成活。對該處理下試管苗營養生長和增殖狀況進行

測量并記錄。試管苗的營養生長統計結果如表3-1所示，經過熱處理后，使用25、

50mg/L利巴韋林處理后的試管苗植株高度達到了24.27、25.34mm,顯著高于對照組

植株的13.42mm,使用75mg/L利巴韋林處理下試管苗株高為17.02mm,高于對照組

植株株高但不顯著。節間數、葉寬、鮮重、干重在不同濃度利巴韋林處理下和對照組

無顯著差異，但從增殖系數來看(圖3-2),50mg/L濃度利巴韋林處理后的植株增殖

系數最大為4.6,顯著高于對照組和使用75mg/L處理的3.4和3.2。說明伴隨著熱處理

脫毒，當利巴韋林濃度增加到了75mg/L時，大籽掰猴桃植株增殖受到了抑制。

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表31不同濃度利巴韋林處理和不同濃度利巴韋林處理結合熱處理對大杼試管苗營養生長的影