DB12DB12/T506—2014大豆轉(zhuǎn)基因成分篩查方法Screeningmethodforgeneticallymodifiedsoybean2014-04-22發(fā)布2014-07-20實施天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)2014年04月首次發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大豆中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR篩查的術(shù)語GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求農(nóng)業(yè)部2031號公告—19—2013轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測抽樣Lectin基因LectingeneCaMV35S啟動子35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus（CaMV）NOS終止子terminatorofnopalinesynthase（NOS）geneCP4-epsps基因5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegenederivedfromAgrobact來源于土壤農(nóng)桿菌株系（Agrobacteriumsp.）CP4株系一段可編碼5-Bt基因Bt（Bacillusthuringiensis）gene來源與蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthur），見的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/crybar/pat基因bialaphosresistancegene/phosphinothricinacetyltransferasbar基因來源于土壤吸水鏈霉菌（Streptomyceshygroscopicuspat基因來源于綠產(chǎn)色鏈霉菌4檢測方法4.1.1實驗用水為重蒸餾水或符合GB/），注：溴化乙錠有致癌作用，配制和使用時應(yīng)戴），）：）：），），4.1.9加樣緩沖液：稱取250.0mg溴酚藍，加10mL水，在室溫下溶解12h；稱取250.0mg二甲基苯腈藍，用10mL水溶解；稱取50.04.1.13引物：大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆Lectin210bpCaMV35SNOSNOS-F：5′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3′NOS-R：5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′mCP4ES-F：5′-ACGGTGAYCGTCTTCCMGTTACmCP4ES-R：5′-GAACAAGCARGGCMGCAACCABtBt-F：5′-GAAGGTTTGAGCAATCBt-R：5′-CGATCAGCCTAGTAAGbarbar-F：5′-GAAGGCACGCAACGCCTACGbar-R：5′-CCAGAAACCCACGTCATGCC262bppatpat-F：5′-GAAGGCTAGGAACGCTTACGpat-R：5′-CCAAAAACCAACATCATGCCA262bp按NY/T672和農(nóng)業(yè)部2031號公告—19—2013規(guī)定的執(zhí)行。按NY/T672和農(nóng)業(yè)部2031號公告—19—2013規(guī)定的執(zhí)行。水2.5μL25mmol/L氯化鎂溶液2.0μL0.25～1.25μL0.25～1.25μL0.025U/μL 2.0μL25.0μL注1：大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PCR檢測反應(yīng)體系中，上下游引物分別為lec-1672F和lec-為0.2μmol/L；CaMV35S啟動子PCR檢測反應(yīng)體系中，上下游引物分別是Bt基因PCR檢測反應(yīng)體系中，上下游引物分別是Bt-F和Bt-R，引物終濃度分別為0.5μmol/L別為0.1μmol/L。LectinNOS5Btbar/pat4.3.5.1.5反應(yīng)結(jié)束后取出PCR管，對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳檢測。各對照PCR反應(yīng)體系中，除模板外，其余組分及PCR反應(yīng)條件與4.3.5.1相同。mL瓊脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插固成凝膠后，放入1×TAE緩沖液中，垂直向上輕輕拔去梳板。取12μLPCR產(chǎn)物與3μL加樣緩沖液條件下電泳檢測。擴增片段是否為目的DNA片段，按照4.3.8和4.3.9的規(guī)定執(zhí)行。5.2.1在試樣的PCR反應(yīng)中，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因得到擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致；而CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt基因、bar/pat基因和CP4-epsps基因均未得到A.2CaMV35S啟動子PCR擴增產(chǎn)物核苷酸序列A.4CP4-epsps基因PCR擴增產(chǎn)物核苷酸序列一