STYLEREF標(biāo)題摘要第2章臨床PCR檢驗(yàn)2.1標(biāo)本的類型在臨床PCR中，血清（血漿）、血液、外周血單核細(xì)胞、痰、棉片、膿液等體液（胸腔積液、腹水、腦脊液、尿液等）、乳液、運(yùn)輸和保存對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響。因此，為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的正確性，必須制定收集、運(yùn)輸和保存臨床樣品的標(biāo)準(zhǔn)程序。2.2標(biāo)本的采集2.2.1標(biāo)本采集時(shí)間采集過(guò)早或過(guò)晚都可能會(huì)給出假陽(yáng)性結(jié)果，所以一定要把握好最佳時(shí)間。2.2.2標(biāo)本采集部位消毒在開(kāi)始取樣之前，應(yīng)清潔取樣點(diǎn)，以去除受污染的微生物或其他雜質(zhì)。但是，這必須是適當(dāng)?shù)模^(guò)度凈化可能會(huì)去除或破壞目標(biāo)微生物。2.2.3采樣量樣本的類型和數(shù)量應(yīng)根據(jù)已經(jīng)識(shí)別出的引起疾病的微生物來(lái)確定，一般要根據(jù)引起充足數(shù)量疾病的微生物樣本來(lái)確定，用于提取核酸和測(cè)量此后的增長(zhǎng)。在病原體含量低的樣品中，樣品的尺寸是測(cè)量的關(guān)鍵。例如，PCR用于血液檢查，血液中的特異性抗原或抗體一般含有較少的病原體，因此需要更多的樣本。2.2.4樣品采集器衛(wèi)生棉條和其他收集的材料必須是一次性的，運(yùn)輸容器還必須是密封的一次性消毒器。材料中使用的抗凝劑和相關(guān)試劑不應(yīng)妨礙基因的擴(kuò)大和測(cè)試。2.2.5采樣過(guò)程中的防污染最好使用一次性材料，而不是直接治療；采集時(shí)應(yīng)特別注意防止污染，混入作業(yè)人員皮膚細(xì)胞、痰盂等；如果使用玻璃器皿，則必須在0.1%高壓水下處理，以使核糖核酸酶能夠存活和降解，這可以抑制聚合酶鏈反應(yīng)。2.3標(biāo)本的運(yùn)送一旦收集了所有的PCR樣品，就應(yīng)暫時(shí)儲(chǔ)存在2-8℃之下，然后再送往實(shí)驗(yàn)室。應(yīng)盡快將其送到實(shí)驗(yàn)室。在無(wú)菌條件下收集的DNA靶標(biāo)樣品應(yīng)在室溫下交付實(shí)驗(yàn)室8小時(shí)；如果核酸是RNA，它可以在室溫下運(yùn)輸10分鐘。如果需要很長(zhǎng)的時(shí)間，它應(yīng)該在冰上運(yùn)輸。2.4標(biāo)本驗(yàn)收、拒收采集的樣本必須從原容器中采集，不能與生化、免疫學(xué)等其他樣本混用，因?yàn)樗鼈冎g感染的可能性很高。應(yīng)拒收溶血或高脂血癥等血樣。對(duì)于沙眼衣原體的擴(kuò)張，應(yīng)在顯微鏡下觀察表皮，因?yàn)椴≡w是在上皮細(xì)胞中形成的，如果下一層上皮沒(méi)有或很少，如果在顯微鏡下觀察到的白細(xì)胞很少，說(shuō)明沒(méi)有收集到合格標(biāo)本。2.5標(biāo)本的預(yù)處理和保存血清(漿)標(biāo)本

如果血清樣品用于DNA提取和檢測(cè)，請(qǐng)遵循血清樣本的一般處理程序。如果EDTA更適合RNA捕獲檢測(cè)，則嚴(yán)禁使用海洛因。因?yàn)樗种屏薖CR的增加，在核酸提取過(guò)程中很難完全清除，防止凝固后1h內(nèi)分離血清，4h內(nèi)分離血漿，放入1.5ml無(wú)菌離心管保存。外周血單個(gè)核細(xì)胞

外周血單個(gè)核細(xì)胞可以在抗凝劑中產(chǎn)生。主要有兩種方法：一種是用淋巴細(xì)胞分離液分離產(chǎn)生外周血單個(gè)核細(xì)胞，另一種是用紅細(xì)胞溶解液分解全血中的紅細(xì)胞，用生理鹽水反復(fù)洗滌可獲得單核細(xì)胞。痰

痰屬于分泌物，臨床上經(jīng)常使用DNA檢測(cè)結(jié)核，痰中含有大量粘稠雜質(zhì)，DNA提取需要初步處理在室溫下用NaOH或變性劑液化約三十分鐘，如果液體樣品不能立即用于DNA提取，可以保存在-70℃下。棉拭子

在檢測(cè)性病病原體的PCR程序中，臨床樣本通常是棉絮，可將棉絮棒置于室溫下適量的生理鹽水溶液中，完全搖勻洗凈，然后在室溫下放置5至10分鐘。立即離心殘余物，隨后的沉淀可用于提取DNA。如果不立即使用膠囊提取核酸，則應(yīng)將其儲(chǔ)存于-70℃下。膿液

膿液如用于分枝桿菌測(cè)定的標(biāo)本，黏液可采用痰標(biāo)本的處理方法來(lái)處理，先液化，再離心取沉淀提取DNA;水樣的膿液則直接離心沉淀用生理鹽水洗2-3次后，即可用于DNA提取。第3章案例分析3.1案例一男性,44歲,腹脹、厭食、乏力間作5年余，加重10余天。飲酒史15年，每天飲白酒約200毫升。患者緣于5年余前無(wú)明確誘因出現(xiàn)上腹部脹滿不適，食欲不振，周身乏力。到當(dāng)?shù)匦l(wèi)生院就診，化驗(yàn)乙肝五項(xiàng)提示“乙肝表面抗原陽(yáng)性，乙肝e抗原陽(yáng)性，乙肝核心抗體陽(yáng)性”，診斷為“慢性乙型病毒性肝炎”，間斷服用“護(hù)肝片”等藥物治療，病情遷延不愈。近10余天來(lái)，患者飲酒后出現(xiàn)上腹部脹滿不適癥狀加重，無(wú)腹痛腹瀉，無(wú)惡心嘔吐。食欲不振，周身乏力。在家口服“護(hù)肝片、奧美拉唑腸溶膠囊”等藥物治療，癥狀無(wú)減輕，為系統(tǒng)診治。（一）體查：T36.5℃,P86次/分,R:15次/分,BP130/80/mmhg。神清語(yǔ)利，周身皮膚粘膜無(wú)黃染，未見(jiàn)蜘蛛痣及肝臟，未見(jiàn)皮下出血點(diǎn)。口唇無(wú)發(fā)紺，咽部無(wú)充血發(fā)紅，扁桃體無(wú)腫大。頸軟無(wú)抵抗，甲狀腺未觸及腫大。胸廓對(duì)稱，語(yǔ)顫無(wú)增強(qiáng)或減弱，叩診呈清音，雙肺呼吸音清，未聞及干濕啰音。心律86次/分，律齊，各瓣膜聽(tīng)診區(qū)未聞及病理性雜音。腹平軟，右上腹輕壓痛，無(wú)反跳痛，肝脾臟未觸及，肝區(qū)叩擊痛，移動(dòng)性濁音陰性，腸鳴音正常存在。雙腎區(qū)無(wú)叩擊痛，雙下肢無(wú)浮腫，四肢肌力、肌張力正常，病理征陰性。（二）輔助檢查乙肝表面抗原：500ng/ml。乙肝病毒指數(shù)：9.3+7。肝功能：ALT(谷丙)：138.6，AST（谷草）：193U/L，GGT（谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶）：867U/L，前白蛋白：41.3mg/dl。尿素氮：2.3mmol/L，肌酐：36.2umol/L，尿酸：440.3umol/L，總膽固醇（TBIL）：6.9mmol/L，高密度脂蛋白：2.91mmol/L，載脂蛋白A：2.60g/L。LDH（乳酸脫氫酶）：248U/L，HBDH（α-羥丁酸脫氫酶）：188U/L。上腹部超聲：肝臟實(shí)質(zhì)回聲增粗。（三）初步診斷1.慢性乙型病毒性肝炎2.高尿酸血癥3.高脂血癥（四）診斷依據(jù)1.患者上腹部脹滿不適，無(wú)腹痛腹瀉惡心嘔吐的癥狀。食欲不振，周身乏力。2.查體：Bp:130/80mmHg。周身皮膚粘膜無(wú)黃染，未見(jiàn)蜘蛛痣和皮下出血點(diǎn)。心肺未見(jiàn)異常。腹平軟，右上腹輕壓有痛感，無(wú)反跳痛，肝脾臟未觸及，肝區(qū)叩擊痛，移動(dòng)性濁音陰性，腸鳴音正常存在。3.輔助檢查資料：化驗(yàn)乙肝表面抗原：500ng/ml。乙肝病毒指數(shù)：9.3+.7。肝功能：ALT：138.6，AST：193U/L，GGT：867U/L，前白蛋白：41.3mg/dl。尿素氮：2.3mmol/L，肌酐：36.2umol/L，尿酸：440.3umol/L，總膽固醇：6.9mmol/L，高密度脂蛋白：2.91mmol/L，載脂蛋白A：2.60g/L。LDH：248U/L，HBDH：188U/L。上腹部超聲：肝臟實(shí)質(zhì)回聲增粗。（五）鑒別診斷1.肝硬化：患者多有慢性肝炎病史，或者長(zhǎng)期飲酒、脂肪肝、自身免疫性肝炎，酒精肝等病史，主要表現(xiàn)為右上腹不適癥狀，周身乏力，可以出現(xiàn)皮膚粘膜黃疸，腹水、上消化道出血等癥狀，上腹部超聲檢查可以鑒別。2.慢性胃炎：患者一般表現(xiàn)為上腹部不適，惡心嘔吐，可以出現(xiàn)上腹部燒灼感，泛酸，食欲不振等癥狀。胃鏡檢查可以鑒別。（六）診治經(jīng)過(guò)入院后完善各項(xiàng)輔助檢查。給予感染性疾病護(hù)理常規(guī)，II級(jí)護(hù)理，低鹽低脂飲食。予護(hù)肝片口服、硫普羅寧、肝水解肽靜點(diǎn)以保肝降酶，恩替卡韋分散片口服以抗病毒，辛伐他丁片口服以調(diào)脂，維生素C、維生素B6靜點(diǎn)以加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)支持。（七）臨床診斷1.慢性乙型病毒性肝炎2.高尿酸血癥3.高脂血癥（八）分析總結(jié)慢性乙型病毒性肝炎是由于HBV感染引起的，如果治療不及時(shí)，可以會(huì)發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。慢性乙型病毒性肝炎患者需要定期復(fù)查肝功能和乙肝病毒指數(shù)。如果肝功能在正常范圍內(nèi)，可暫時(shí)不用抗病毒藥物治療。如果乙肝病毒指數(shù)明顯升高，谷丙轉(zhuǎn)氨酶數(shù)值在正常數(shù)值的2倍以上，無(wú)禁忌癥，需要常規(guī)使用抗病毒藥物治療。目前比較常用的抗病毒藥物包括a-2b干擾素、聚乙二醇干擾素、拉米夫定片、恩替卡韋分散片等藥物，可以根據(jù)患者病情選擇，一定要按照療程用藥，避免隨意停藥，導(dǎo)致病情反彈。要注意定期復(fù)查肝功能、乙肝五項(xiàng)、乙肝病毒指數(shù)等項(xiàng)目。要注意飲食控制，不要吃辛辣食物，避免飲酒，防止損傷肝細(xì)胞。3.2案例二病人男，42歲，發(fā)熱、食欲減退時(shí)達(dá)10天。10天前不明原因出現(xiàn)發(fā)熱，體溫在38℃左右,伴有頭痛，全身乏力、食欲減退等癥,自認(rèn)為是“感冒”，口服“康秦克”等藥物，5天后體溫下降至正常，食欲好轉(zhuǎn)，但家人發(fā)現(xiàn)患者皮膚發(fā)黃因此來(lái)醫(yī)院就診。（一）體檢:T36.5℃，p70次/分，R20次/分，BP110/70mHg鞏膜及皮膚黃染,未見(jiàn)肝掌且無(wú)出血點(diǎn)，淺表淋巴結(jié)無(wú)腫大，頸軟，心肺正常。腹軟，右肋下2.3cm質(zhì)軟有壓痛感，表面光滑，脾未及。（二）實(shí)驗(yàn)室檢查:血常規(guī),血紅蛋白126g/L，白細(xì)胞5.0×10L，中性粒細(xì)胞0.66，淋巴細(xì)胞0.34，大便、尿常規(guī)正常。（三）肝功檢查:ALT450U/L，血清抗HAV-1gM(+)。（四）初步診斷：1.甲型肝炎病毒2.黃疸（五）診斷分析依據(jù)HAV主要在肝細(xì)胞胞漿內(nèi)復(fù)制，通過(guò)膽汁從糞便中排出，HAV只有一個(gè)血清型和一個(gè)抗原抗體系統(tǒng)，肝炎又分為急性和慢性，急性黃疸型肝炎又分為。黃疸前期，黃疸期，恢復(fù)期三個(gè)階段，總病程2～4個(gè)月，黃疸前期甲型肝炎于物型肝炎發(fā)病較急，常伴全身癥狀發(fā)熱，全身乏力，消化道癥狀，食欲不振，厭油，惡心，嘔吐，腹痛，腹瀉，尿色逐漸加深。黃疸期自覺(jué)癥狀好轉(zhuǎn)，發(fā)熱消退，但尿色繼續(xù)加深，出現(xiàn)黃疸約于二周內(nèi)達(dá)高峰。（六）輔助檢查肝功能檢查1.血清酶的檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)是反映肝細(xì)胞功能的最常用指標(biāo);天門冬氨酸氨基酶(AST)存在于線粒體中，意義與ALT相同;堿性磷酸酶(ALP)在肝外梗阻性黃疸、淤膽型肝炎患兒童中可明顯升高；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶在肝炎活動(dòng)期時(shí)可升高，在肝癌或膽管阻塞、藥物性肝炎者中可顯著升高。2.膽紅素黃疸型肝炎及部分肝硬化患者血清直接和間接膽紅素測(cè)定均升高，但前者幅度高于血清膽紅素是判定肝損傷程度的重要指標(biāo)之一。急性肝炎早期尿中尿膽原增加，黃疸期尿膽原和紅素均增加，梗阻性黃疸時(shí)尿膽紅素強(qiáng)陽(yáng)性而尿膽原可陰性。3.血清蛋白慢性肝炎和肝硬化時(shí)常有血清清蛋白減少和球蛋白增加。形成A/G值下降，甚置。4.凝血酶原活動(dòng)度凝血酶原活動(dòng)度高低與肝損害程度成反比，凝血酶原活動(dòng)度<40%時(shí)提示肝損傷嚴(yán)重。（七）超聲檢查動(dòng)態(tài)的觀察肝脾的形態(tài)大小血管分布情況，觀察膽囊大小，形態(tài)，膽囊壁的厚薄，探測(cè)有腹腔積液，有無(wú)肝硬化，顯示肝門部及后腹部淋巴結(jié)是否腫大。（八）肝穿刺活體組織檢查肝穿刺活體組織檢查能準(zhǔn)確判斷。慢性肝炎患者所處的病變階段及預(yù)后，同時(shí)可進(jìn)行原位雜交和原位聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)確定病原及病毒復(fù)制狀態(tài)。臨床診斷為急性黃疸型甲型病毒型肝炎（九）治療原則：病毒性肝炎目前還缺乏可靠的特效治療方法，治療原則以適當(dāng)休息合理營(yíng)養(yǎng)為主，輔以適當(dāng)?shù)乃幬镏委煟苊怙嬀坪褪褂脫p害肝臟的藥物。3.3案例三患者男，68歲，14年前診斷為MPN-PV（骨髓增殖），曾使用羥基脲、別嘌醇及皮下注射干擾素進(jìn)行治療。現(xiàn)外周血常規(guī)檢查：白細(xì)胞計(jì)數(shù)：10.5*109/L升高、血紅蛋白測(cè)定：64g/L下降、血小板計(jì)數(shù)：75*109/L，白細(xì)胞分類，可見(jiàn)幼粒及幼紅細(xì)胞；巨脾，甲乙線：10cm，甲丙線：11cm丁戊線1cm；分子生物學(xué)檢查：jak2/v617f定量82.63%；BCR/ABLP190、BCR/ABLP210定量均為0；JAK2-Exon13、MPL-Exon10、CALR-Exon9均陰性；骨髓活檢：骨髓增生極度活躍，粒系，紅系，巨系細(xì)胞增生伴巨核細(xì)胞形態(tài)異常及纖維組織增生（MF-2）；骨髓細(xì)胞涂片：增生重度減低，成紅細(xì)胞易見(jiàn)淚滴形紅細(xì)胞。見(jiàn)圖5.1圖5.1易見(jiàn)淚滴形紅細(xì)胞

骨髓涂片

瑞氏染色x1000圖5.2淚滴形紅細(xì)胞易見(jiàn)

偶見(jiàn)原始細(xì)胞

骨髓涂片

瑞氏染色x1000圖5.3PV后MF診斷標(biāo)準(zhǔn)（WHO，2017）乙型肝炎病毒是引起病毒性肝炎的主要病原體之一。根據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，全球約有3.5億乙肝病毒攜帶者，我國(guó)約50%~70%的人群感染過(guò)乙肝病毒，其中乙肝病毒攜帶者已超過(guò)1.3億，肝癌發(fā)病率也在增加。肝癌偏愛(ài)的人身上往往有8個(gè)特點(diǎn)，分別是：1.得過(guò)乙肝2.有肝硬化3.家族中有肝癌患者4.過(guò)了40歲更要注意5.嗜酒如命6.喜歡吃霉變食品7.長(zhǎng)期患有膽結(jié)石8.長(zhǎng)期服用某些特定傳統(tǒng)藥物經(jīng)過(guò)四個(gè)案例分析數(shù)據(jù)得出下圖； 圖5.4圖5.5圖5.5圖5.6 結(jié)論也就是說(shuō)，分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、標(biāo)準(zhǔn)化、質(zhì)量管理等領(lǐng)域。由衛(wèi)生部開(kāi)發(fā)，對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展起到了重要作用。交叉污染的醫(yī)療檢查在一定程度上得到了解決。分子生物學(xué)的應(yīng)用主要與完全自動(dòng)化的醫(yī)療系統(tǒng)的發(fā)展有關(guān)。可有效處理聚氯乙烯污染問(wèn)題的檢查。此外，分子生物學(xué)技術(shù)。例如，由于自擴(kuò)增系統(tǒng)等技術(shù)的發(fā)展，得到了人們的認(rèn)可。分子生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化大大減少了醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)過(guò)程中交叉污染的相關(guān)問(wèn)題，使得醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)難度大，可以提高整體效率。分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的臨床應(yīng)用，主要指應(yīng)用分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)人類疾病進(jìn)行診斷和研究的過(guò)程。包括病原微生物的診斷、人類基因組相關(guān)疾病的診斷惡性腫瘤個(gè)體化治療靶點(diǎn)的選擇以及在移植配型和個(gè)體識(shí)別方面的應(yīng)用。分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)通過(guò)檢測(cè)病原微生物的特征性基因位點(diǎn)以及患者自身基因結(jié)構(gòu)的變化或表達(dá)異常的存在，獲得疾病的診斷依據(jù)，完成疾病的分子診斷。隨著分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的飛速發(fā)展,分子診斷、基因診斷正日漸成為臨床上快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行疾病診斷的重要途徑和手段。參考文獻(xiàn)[1]王海英.分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2011,17(06):16.[2]李鵬.現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,(03):161.[3]楊振華.為21世紀(jì)中國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)事業(yè)崛起而奮斗——寫于本刊更名之際[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2000,(01):4.[4]姚均,何忠平,張福杰,等.核酸序列擴(kuò)增早期診斷人類免疫缺陷病毒感染[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2002,(06):42.[5]胡頌恩.分子生物學(xué)與檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2018.[6]武衛(wèi)杰,冷遠(yuǎn)逵,沈夢(mèng)飛等.基于功能納米材料的液相生物芯片檢測(cè)技術(shù)[J].化學(xué)進(jìn)展,2019,31(2/3):283-299.[7]徐疏梅.新一代DNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用與研究進(jìn)展[J].徐州工程學(xué)院學(xué)報(bào),2018,33(4):60