專題1

基因工程基因工程的概念基因工程是把一種生物的遺傳物質移到另一種生物的細胞中去，并使這種遺傳物質所帶的遺傳信息在受體細胞中表達。基因工程核心是構建重組DNA分子，又叫做DNA重組技術。基礎理論：DNA是遺傳物質；DNA雙螺旋結構和中心法則的確立；遺傳密碼的破譯。技術支持：基因轉移載體的發現；工具酶的發明；DNA體外重組的實現；重組DNA表達實驗的成功。基因工程的原理：基因重組（一）基因工程的基本工具1.“分子手術刀”——限制性核酸內切酶（限制酶）功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。2.“分子縫合針”——DNA連接酶：縫合相同黏性末端的磷酸二酯鍵。3.“分子運輸車”——載體載體具備的條件：①能在受體細胞中復制并穩定保存。②具有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。③具有標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。最常用的載體是質粒,其它載體：λ噬菌體，動植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的獲取：目的基因未知采取建立基因文庫獲得，目的基因已知常是人工合成或用PCR擴增目的基因，人工合成目的基因的常用方法有反轉錄法和化學合成法。第二步：形成重組DNA分子過程：將目的基因與載體結合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。如果以質粒作為載體，首先要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個切口，露出黏性末端。然后用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端。將切下的目的基因的片段插入到質粒的切口處，再加入適量的DNA連接酶，質粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就會因堿基互補配對而結合，形成了一個重組DNA分子。考慮兩兩分子連接，常有質粒—質粒；目的基因—目的基因；質粒—目的基因三種。第三步：將重組DNA分子導入受體細胞_常用的方法：將目的基因導入植物細胞：采用最多的方法是農桿菌轉化法，將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是顯微注射技術。此方法的受體細胞多是受精卵。將目的基因導入微生物細胞：原核生物作為受體細胞的原因是繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少，最常用的原核細胞是大腸桿菌，其轉化方法是：先用CaCl2處理細胞，增大其細胞壁的通透性，使重組DNA分子進入大腸桿菌，完成導入過程。第四步：篩選含目的基因的受體細胞：質粒—質粒結合的可以在兩種選擇培養基上存活；目的基因—目的基因都不存活；質粒—目的基因一種培養基上存活。第五步：目的基因的表達：可以檢測目的基因是否轉錄出了mRNA，方法是采用用標記的目的基因作探針與相應的mRNA雜交。可以檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原－抗體雜交。有時還可以進行個體生物學水平的鑒定。如轉基因抗蟲植物是否出現抗蟲性狀。（三）基因工程的應用（1）植物基因工程成果：略（2）動物基因工程成果：略（3）基因工程與疾病治療：基因工程藥物（利用轉基因工程菌生產淋巴因子、抗體、疫苗等）。注：如果工程菌為原核生物，因其沒有內質網、高爾基體，所以不能生產糖蛋白類物質。大腸桿菌中若導入人的胰島素基因，合成的是人的胰島素原，進一步加工后才具生物活性。基因治療：把正常的外源基因導入病人體內，以糾正和補償基因的缺陷，使該基因表達產物發揮作用。但其并沒有替換原來的基因。常涉及考點還有：1.轉基因生物不屬于新物種，很多仍可以與原物種雜交，造成基因污染。2.轉入基因所在染色體的同源染色體上無等位基因等。專題2細胞工程克隆：概念：即無性繁殖系，指不通過兩個分子、兩個細胞或兩個個體的結合，只由一個模板分子、母細胞或母體直接形成新一代分子、細胞或個體。（一）植物細胞工程1.理論基礎（原理）：細胞全能性全能性表達的難易程度：受精卵＞生殖細胞＞干細胞＞體細胞；植物細胞＞動物細胞2.植物組織培養技術：取外植體（離體的器官、組織、細胞），注意要消毒（可用次氯酸鈉、無菌水處理，在超凈工作臺上操作）；將外植體接種到滅菌后的培養基，并封口（培養基成分：蔗糖、生長素、細胞分裂素、水、礦質元素、瓊脂）；通過脫分化（由高度分化的植物器官、組織或細胞產生愈傷組織的過程），形成愈傷組織（特點：排列疏松而無規則，是一種高度液泡化的薄壁細胞。）；將含有愈傷組織培養物的試管放在搖床上，通過液體懸浮培養可以分散成單細胞，這種單細胞細胞質豐富、液泡小而細胞核大，這是胚性細胞的特征。適宜的培養基中，這種單細胞可發育成胚狀體，進行轉接到分化培養基上，進行再分化（產生的愈傷組織繼續進行培養，又可以重新分化成根、芽等器官。生長素濃度較高利于生根，細胞分裂素濃度較高利于生芽）；再分化過程一定要光下，一段時間后誘導出試管苗；移栽到大田。用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細胞產物的工廠化生產。植物細胞全能性的體現：植物體的每個生活細胞，即使是已經高度成熟和分化的細胞，都保持了恢復到分生狀態的能力，都具有遺傳上的全能性。由于不同種類植物或同種植物的不同基因型個體之間遺傳性的差異，細胞的全能性的表達程度大不相同。長期培養中培養物胚胎發生和器官形成能力下降的可能原因有染色體畸變、細胞核變異或非整倍體產生等。而且不可逆；細胞或組織中激素平衡被破壞，或細胞對外源生長物質的敏感性發生改變；隨時間推移，由于其他各種原因產生缺乏成胚性的細胞系。要克隆成功，要做到:①深入探討特定植物細胞全能性的表達條件。②在植物克隆試驗研究中，盡量選擇優良、細胞全能性表達充分的基因型。3.其他技術植物細胞培養：植物細胞在體外條件下得存活或生長，不形成組織，以生產次生代謝產物為目的。植物器官培養：將植物各種器官從母體上分離，放在無菌人工環境上進一步發育成幼苗。原生質體培養：在0.5—0.6mol／L的甘露醇溶液環境（較高滲透壓）下用纖維素酶和果膠酶混合液處理細胞，獲得球形原生質體。（二）動物細胞工程1.動物細胞培養（1）概念：動物細胞培養就是從動物機體中取出相關的組織，經過機械消化和胰酶消化，將它分散成單個細胞，然后放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和繁殖。（2）動物細胞培養的流程：取動物組織塊（動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）→剪碎→用胰蛋白酶（PH值適中，可消化組織中的膠原纖維和細胞外成分）處理分散成單個細胞→制成細胞懸液→轉入培養瓶中進行原代培養→貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶處理分散成單個細胞繼續傳代培養。①細胞系：可連續傳代的細胞。原代培養物在首次傳代時就成為細胞系，能連續培養下去的稱連續細胞系，不能連續培養下去的稱有限細胞系。二倍體細胞通常為有限細胞系。連續細胞系多數具有異倍體核型。連續細胞系有的是惡性細胞系，具有異體致瘤性；有的連續細胞系具不死性，但保留了接觸抑制，不致癌。細胞系指可傳代的細胞。②細胞株：通過一定的選擇或純化的方法，從原代培養物或細胞系中獲得的具有特殊性質的細胞。一般具有恒定的染色體鉏型、同功酶類型、病毒敏感性和生化特性等。可連續多次傳代的細胞株稱連續細胞株，傳代次數有限的稱有限細胞株。細胞株是具有特殊性質的細胞系。（4）動物細胞培養技術的應用：制備病毒疫苗、制備單克隆抗體、檢測有毒物質、培養醫學研究的各種細胞。2.動物細胞克隆培養：（1）基本要求：必須肯肯定所建成的克隆來源于單個細胞。（2）提高細胞克隆形成率的措施：①選擇適宜的培養基：（無菌、無毒的環境）培養液應進行無菌處理。通常還要在培養液中添加一定量的抗生素，以防培養過程中的污染。此外，應定期更換培養液，防止代謝產物積累對細胞自身造成危害。②營養：合成培養基成分：糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。通常需加入血清等天然成分。以滋養細胞支持生長。加入激素刺激（如胰島素）。③適宜條件：如溫度，加入激素刺激（如胰島素）。④氣體環境：（3）用途：從普通細胞系中分離出缺乏特殊基因的突變細胞系3.動物組織培養：動物組織在體外及人工條件下維持生活狀態或生長特性。動物組織培養過程中可伴隨組織分化。4.動物體細胞核移植技術和克隆動物（1）哺乳動物核移植可以分為胚胎細胞核移植（比較容易）和體細胞核移植（比較難）。（2）選用去核卵(母)細胞的原因：卵(母)細胞比較大，容易操作；卵(母)細胞細胞質多，營養豐富，細胞質具有調控細胞核發育的作用。動物難以克隆的根本原因：在動物個體發育過程中，分化的結果使得細胞在形態和功能上高度特化，這是由于細胞中伴隨著他們在發育過程中時間和空間的變化，基因表達的調控使得細胞中合成了專一的蛋白質。細胞分化使得細胞發生了基因的差異表達。來自動物的體細胞，由于均已發生分化，基因組中的基因活動很不完全，不能像受精卵那樣發揮細胞的全能性。（3）體細胞核移植的大致過程是：略（4）體細胞克隆成功的部分原因：重組卵細胞最初分裂時雖然復制了ＤＮＡ，但基因的轉錄并未開始；同時，供體核ＤＮＡ開始丟失來源于乳腺細胞的調節蛋白，這是這些調節蛋白最初阻止了核基因的表達。專題3胚胎工程（一）動物胚胎發育的基本過程1、胚胎工程是指對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術，經過處理后獲得的胚胎，還需移植到雌性動物體內生產后代，以滿足人類的各種需求。研究對象主要限定于高等脊椎動物，主要內容有：體外受精、胚胎體外培養、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干細胞等。2、動物胚胎發育的基本過程（1）受精場所是母體的輸卵管上段，完成受精作用時已開始分裂。（2）卵裂期：特點：細胞有絲分裂，細胞數量不斷增加，但胚胎的總體體積并不增加，或略有減小。卵裂產生的細胞團稱卵裂球，卵裂球含2—8個細胞時，每一個細胞都具有全能性。（3）桑椹胚：特點：胚胎細胞數目達到32個左右時，胚胎形成致密的細胞團，形似桑椹。（4）囊胚：特點：細胞開始出現分化（該時期細胞的全能性仍比較高）。聚集在胚胎一端個體較大的細胞稱為內細胞團，中間的空腔稱為囊胚腔。外表面為滋養層，將來發育成胚胎的附屬結構或胚外結構。（5）原腸胚：特點：有了三胚層的分化，具有原腸腔。（二）胚胎干細胞：哺乳動物的胚胎干細胞簡稱ES細胞，來源于早期胚胎中分離出來。具有發育全能性和二倍體核型。具有胚胎細胞的特性，在形態上表現為體積小，細胞核大，核仁明顯；在功能上，具有發育的全能性，可分化為成年動物體內任何一種組織細胞。胚胎干細胞的主要應用是——胚胎干細胞培養：培養胚胎干細胞需要一種培養體系，能促進胚胎干細胞的生長，同時抑制胚胎干細胞的分化。培養胚胎干細胞時，在培養皿底部制備一層飼養層（成纖維細胞），飼養層可分泌抑制細胞分化的物質，同時滿足干細胞的生長。（三）胚胎工程的應用1.體外受精和胚胎的早期培養主要方法：用促性腺激素處理，使其排出更多的卵子，然后，借助超聲波探測儀、腹腔鏡等直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。采集的卵母細胞，都要在體外經人工培養成熟后，才能與附睪中取出的成熟精子在獲能培養液或專用的受精溶液中完成受精。胚胎的早期培養：精子與卵子在體外受精后，應將受精卵移入發育培養液中繼續培養，以檢查受精狀況和受精卵的發育能力。培養液成分較復雜，除一些無機鹽和有機鹽外，還需添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養成分，以及血清等物質。不同發育時期的培養液成分也不同。2.胚胎移植(1)指將雌性動物的早期胚胎，或者通過體外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態相同的其它雌性動物的體內，使之繼續發育為新個體的技術。不同動物胚胎移植的時間不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚階段才能進行移植，小鼠、家兔等實驗動物可在更早的階段移植，人的體外受精胚胎可在8—16個細胞階段移植。)最適時期是發育到8細胞以上的胚胎，必須在原腸胚之前，不能直接移植受精卵。地位：如轉基因、核移植，或體外受精等任何一項胚胎工程技術所生產的胚胎，都必須經過胚胎移植技術才能獲得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”(2)基本程序主要包括：①對供、受體的選擇和處理。選擇遺傳特性和生產性能優秀的供體，有健康的體質和正常繁殖能力的受體，供體和受體是同一物種。并用促性腺激素進行同期發情處理，使用促性腺激素對供體母牛做超數排卵處理。②配種或人工授精。③對胚胎的收集、檢查、培養或保存。配種或輸精幾天后，用特制的沖卵裝置，把供體母牛子宮內的胚胎沖洗出來(也叫沖卵)。對胚胎進行質量檢查。④對胚胎進行移植，可移植到輸卵管或子宮