DB51/T1082—2010飼料中伏馬毒素B?的測定高效液相色譜法IDB51/T1082-2010 Ⅱ1范圍 12規范性引用文件 13原理 14試劑和溶液 15儀器與設備 26試樣制備 27分析步驟 28結果計算 39精密度 3 4Ⅱ本標準的附錄A為資料性附錄。本標準由四川省畜牧食品局提出并歸口。本標準由四川省質量技術監督局批準。本標準由四川省飼料工作總站負責起草。本標準起草人：柏凡、李云、魏敏、王宇萍、趙立軍、張靜。1飼料中伏馬毒素B?的測定高效液相色譜法本標準規定了測定飼料中伏馬毒素B?的含量的高效液相色譜法(HPLC)。本標準適用于配合飼料、濃縮飼料及飼料原料的測定。本標準中伏馬毒素B?的檢出限為0.2mg/kg。下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動物飼料試樣的制備試樣經甲醇-水提取，離心、過濾后，取濾液經過免疫親和柱凈化，經衍生化，用高效液相色譜儀-熒光檢測器檢測，外標法計算伏馬毒素B1的含量。除特殊說明外，所有試劑均為分析純，色譜用水符合GB/T6682一級用水的規定。4.16提取液：甲醇+水=80+20(體積比)。4.17衍生劑：稱取5mg鄰苯二甲醛，溶于1mL甲醇，用0.05mol/L四硼酸鈉溶液定容到50mL,加入25μL巰基乙醇，混勻，備用(4℃可保存一周)。溶于1000mL水，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH至7.0。2DB51/T1082-20104.19伏馬毒素B?標準品：含量大于98%。4.19.1標準貯備液：精密稱取10mg伏馬毒素B1標準品，用乙腈+水(1+1)溶解、定容至100mL,此貯備液濃度為100μg/mL,置于2～8℃冰箱中保存，有效期6個月。1.0μg/mL,5.0μg/mL,25μg/mL,50μg/mL。置于2～8℃冰箱中保存，有效期6個月。注1:凡接觸伏馬毒素B的容器，需浸入4%次氯酸鈉(NaOC1)溶液，放置半天后清洗備用。注2:為了安全，分析人員操作時須帶上醫用乳膠手套，在通風櫥內操作。4.19.3伏馬毒素免疫親和柱。5.2超聲波清洗器。5.3離心機：轉速為5000r/min以上。5.4超純水處理器。5.5渦旋混合器。5.6高效液相色譜儀：配備熒光檢測器。5.7氮吹儀。按GB/T14699.1規定采集試樣后，按GB/T20195規定，選取具有代表性的實驗室樣品1kg,四分法縮減分取200g左右，粉碎過1mm孔篩，混勻裝7.1.1提取稱取20g試樣(精確至0.01g)于錐形瓶中，加入2g氯化鈉(4.6),50mL提取液(4.16),超聲提取20min,離心，取上清液過濾，準確量取濾液5.0mL,加入20mLPBS(4.18)稀釋，混勻，待凈化。7.1.2凈化將免疫親和柱底帽除去。剪去親和柱的蓋帽，與10ml注射器連接。待免疫親和柱中緩沖液排出后，精確吸取上述稀釋液5.0mL過免疫親和柱(流速1-2滴/秒),再依次用5mLPBS緩沖液淋洗柱子，抽干柱子，用2.0mL甲醇洗脫，收集洗脫液于50℃水浴中氮氣吹干，重新溶解于200μL的甲醇+水(50+50,體積比)中，待衍生化。7.1.3衍生化取樣品處理液和標準溶液各100μL,各加300μL衍生劑(4.17),混勻，過0.45μm濾膜，在2min內7.2.1色譜柱：C?8柱，柱長250mm,內徑4.6mm,粒度5μm;或性能相當的色譜柱。7.2.3流動相：甲醇+磷酸二氫鈉(0.1mol/L,磷酸調節pH至3.3)=77+23(體積比)。7.2.4流速：0.8mL/min。7.2.5檢測器：熒光檢測器，Ex:330nm,Em:440nm。7.2.6進樣量：50μL。3DB51/T1082-20107.3測定按上述色譜條件，分別將標準溶液和試樣溶液上機測定，按照保留時間進行定性，單點或多點校正，外標法定量。當分析物濃度不在線性范圍內時，應將分析物稀釋或者濃縮后再進行檢測。8結果計算試樣中伏馬毒素B?的含量X,以質量分數毫克每千克(mg/kg)表示，單點校正按式(1)計算：V——上機定容體積，單位為毫升(mL); 伏馬毒素B?標準溶液對應的色譜峰面積響應值；試樣溶液對應的色譜峰面積響應值；Cs——伏馬毒素B?標準溶液的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);m——試樣質量，單位為克(g);n——稀釋倍數。結果用平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數字。9精密度在重復性試驗條件下兩次平行測定結果的相對偏差不大于10%。4DB51/T1082-2010(資料性附錄)伏馬毒素B?標準色譜圖0.0