DB51/T1081—2010飼料中赭曲霉毒素A的測定高效液相色譜法I Ⅱ1范圍 12規范性引用文件 13原理 14試劑和溶液 15儀器與設備 26試樣制備 27分析步驟 28結果計算 29精密度 3 4Ⅱ本標準的附錄A為資料性附錄。本標準由四川省畜牧食品局提出并歸口。本標準由四川省質量技術監督局批準。本標準由四川省飼料工作總站負責起草。本標準起草人：柏凡、趙立軍、李云、高慶軍、甄陽光、張靜。1DB51/T1081-2010飼料中赭曲霉毒素A的測定高效液相色譜法本標準規定了測定飼料中赭曲霉毒素A的含量的高效液相色譜法(HPLC)。本標準適用于配合飼料、濃縮飼料及飼料原料的測定。本標準中赭曲霉毒素A的檢出限為30μg/kg。下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動物飼料試樣的制備試樣經甲醇-水提取，離心、過濾后，取濾液經過免疫親和柱凈化，濃縮，用高效液相色譜儀-熒光檢測器檢測，外標法計算赭曲霉毒素A的含量。除特殊說明外，所有試劑均為分析純，色譜用水符合GB/T6682一級用水的規定。4.2氯化鈉。4.3氯化鉀。4.4磷酸鈉。4.7提取液：甲醇+水=80+20(體積比)。4.9磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取8.0g氯化鈉、1.44g磷酸氫于1000mL水，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH至7.0。4.10清洗緩沖液：0.1mL吐溫-20溶于1LPBS(4.9)緩沖液中。4.11赭曲霉毒素A標準品：含量大于98%。4.11.1標準貯備液：精密稱取10mg赭曲霉毒素A標準品，用乙腈溶解、定容至100mL,此貯備液濃度為100μg/mL,置于冰箱中2～8℃保存，有效期6個月。4.11.2標準工作溶液：分別準確移取赭曲霉毒素A貯備液，用流動相配制成標準工作溶液：0.001μg/mL,0.01μg/mL,0.1μg/mL,0.5μg/mL,1.0μg/mL,5.0μg/mL。置于冰箱中2～8℃保存，有效期24.11.3赭曲霉毒素免疫親和柱。5儀器與設備5.1分析天平：感量0.1mg。5.2超聲波清洗器。5.3離心機：轉速為5000r/min以上。5.4超純水處理器。5.5渦旋混合器。5.6高效液相色譜儀：配備熒光檢測器。5.7氮吹儀。5.80.45μm濾膜。6試樣制備按GB/T14699.1規定采集試樣后，按GB/T20195規定，選取具有代表性的實驗室樣品1kg,四分法縮減分取200g左右，粉碎過1mm孔篩，混勻裝入磨口瓶中備用。7分析步驟7.1試樣溶液的制備稱取20g試樣(精確至0.01g)于錐形瓶中，加入2g氯化鈉(4.2),50mL提取液(4.7),超聲提取20min,離心，取上清液過濾，準確量取濾液5.0mL,加入20mLPBS(4.9)稀釋，混勻，待凈化。將免疫親和柱底帽除去。剪去親和柱的蓋帽，與10ml注射器連接。待免疫親和柱中緩沖液排出后，精確吸取上述稀釋液5.0mL過免疫親和柱(流速1-2滴/秒),再依次用5mL清洗緩沖液(4.10)、5mL蒸餾水淋洗柱子，抽干柱子，用2.0mL甲醇洗脫，收集洗脫液于50℃水浴中氮氣吹干，準確加入流動相1000μL,渦旋30s,過0.45μm濾膜，上機測定。7.2色譜條件7.2.1色譜柱：C?8柱，柱長250mm,內徑4.6mm,粒度5μm;或性能相當的色譜柱。7.2.2柱溫：30℃。7.2.3。7.2.4流速：1.0mL/min。7.2.5檢測器：熒光檢測器，Ex:330nm,Em:460nm。7.2.6進樣量：50μL。按上述色譜條件，分別將標準溶液和試樣溶液上機測定，按照保留時間進行定性，單點或多點校正，外標法定量。當分析物濃度不在線性范圍內時，應將分析物稀釋或者濃縮后再進行檢測。8結果計算試樣中赭曲霉毒素A的含量X,以質量分數毫克每千克(mg/kg)表示，單點校正按式(1)計算：式中：V——上機定容體積，單位為毫升(mL);3 赭曲霉毒素A標準溶液對應的色譜峰面積響應值；A——試樣溶液對應的色譜峰面積響應值；Cs——赭曲霉毒素A標準溶液的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);m——試樣質量，單位為克(g);n——稀釋倍數。結果用平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數字。9精密度