江蘇省地方標準DB32/T5062—2025人類腸道菌群樣本制備和保藏技術規范Technicalspecificationforhumanintestinalflorasamplepreparationandpreservation2025-02-21發布2025-03-21實施江蘇省市場監督管理局中國標準出版社發布出版Ⅰ前言 Ⅲ 2規范性引用文件 3術語和定義 4基本要求 5.1方案制定 5.2知情同意 5.3糞便樣本 5.4腸道菌群樣本 7數據管理 附錄A（資料性）布里斯托大便分類法 附錄B（資料性）數據記錄明細 參考文獻 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由江蘇省衛生健康委員會提出并組織實施。本文件由江蘇省衛生健康標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：蘇州市疾病預防控制中心、南京醫科大學、徐州市賈汪區疾病預防控制中心、蘇州善佰生物技術有限公司。DB32/T5062—20251人類腸道菌群樣本制備和保藏技術規范本文件規定了人類腸道菌群樣本制備和保藏的基本要求、制備流程、保藏要求和數據管理等技術本文件適用于人類腸道菌群樣本制備和保藏。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T37864生物樣本庫質量和能力通用要求GB/T39725信息安全技術健康醫療數據安全指南GB/T41908人類糞便樣本采集與處理GB/T41910洗滌糞菌質量控制和糞菌樣本分級WS233病原微生物實驗室生物安全通用準則3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。腸道菌群intestinalflora寄居在腸道內的正常菌群、條件致病菌和致病菌等微生物群系。生物樣本庫biobank開展生物樣本獲得和儲存過程的合法實體或其部分，獲得和儲存過程包括生物樣本及相關數據的收布里斯托大便分類法Bristolstoolscale依據糞便不同形態和質地進行分類的一種方法，從1型最硬糞塊到7型水樣便共分7種類型，常以圖片展示和文字描述的視覺性圖表形式呈現。注：又稱Bristol評分。批次lot在規定限度內具有同一性質和質量，并在同一連續生產周期中生產出來的一定數量的生物樣本為一批次。2DB32/T5062—2025香農-威納指數ShannonWienerindex從物種種類數和均勻性（各物種的相對比例）兩方面來衡量群落物種多樣性的一項指標，該指數越大代表群落的物種多樣性越高。保存液tabilizer能保存糞便微生物固相和核酸物質的化學試劑。注：保存液的主要作用為：a）固定微生物，使微生物不能繼續生長變化，相關蛋白酶等失去活性；b）保護脫氧核糖核酸（DNA穩定DNA使其不易發生降解和變異。4基本要求4.1從事人類腸道菌群樣本制備和保藏活動的生物樣本庫應符合GB19489、GB/T37864和WS233的規定，相關設備、環境和消毒隔離應滿足普通型BSL-2實驗室要求，所有腸道菌群樣本制備用設備、耗材和所在環境應保證無菌。4.2實施人類腸道菌群樣本制備和保藏的人員應符合GB/T41908和GB/T41910的規定。4.3應建立質量管理體系規范人類糞便樣本采集和質量控制，以及人類腸道菌群樣本制備、質量控制和保藏的全過程。4.4人類腸道菌群樣本制備和保藏過程中產生的各類數據應及時、準確和清晰地記錄、保存和備份。4.5應對樣本捐贈人提供足夠的隱私保護，樣本捐贈人信息管理應符合GB/T39725的規定。5.1方案制定在生物樣本采集前，應明確生物樣本采集目的、種類、數量、時間和周期，明確樣本捐贈人的納入排除標準，制定詳細的生物樣本采集、處理、質量控制和保藏方案。5.2知情同意生物樣本采集和保藏項目應通過倫理審查，招募人員應接受規范化培訓，應使用樣本捐贈人能夠理解的簡明語言傳達信息，使他們了解采集樣本的風險、獲益和可能產生的后果，使其知情并征得其同意，信息應包括但不限于：——捐贈人納入排除標準；——捐贈人準備說明；——捐贈人知情同意要求；——捐贈人的權利、義務、風險和可能產生的后果；——生物樣本采集種類、數量、采集容器類型和采集方法等采集內容；——糞便樣本接收標準；——保護捐贈人個人信息的政策；——特殊處理要求等其他需要溝通的內容。DB32/T5062—202535.3糞便樣本糞便采集地點宜鄰近樣本質量控制和制備的實驗室。捐贈人解大便前應先進行手部清潔并排盡尿液，宜使用潔凈的蹲式便器，在其內放置一個內徑不低于10cm，體積不低于500mL，無菌，具有易于開啟且密封性良好蓋子的采集容器，打開采集容器蓋子，將糞便排入采集容器。采集完成后即時密閉采集容器，將糞便樣本、樣本相關信息和知情同意書交實驗人員。5.3.2質量控制5.3.2.1稱量并記錄糞便樣本重量，每份樣本不低于100g為合格。5.3.2.2觀測糞便樣本性狀，不應混合污染物，如尿液、污水和消毒劑等異物。樣本。5.3.2.4每批次糞便樣本應留樣，用于質量控制和溯源。5.3.2.5每批次糞便樣本應隨機抽樣1份，按表1進行質量控制檢測；長期捐贈人的糞便樣本應每2個月另行隨機抽樣1份留樣，按表2進行質量控制檢測。表1每批次糞便樣本質量合格項目指標質量控制項目結果檢測方法寄生蟲未檢出鏡檢法蟲卵未檢出鏡檢法夏科萊登結晶未檢出鏡檢法孢子未檢出鏡檢法菌絲未檢出鏡檢法隱血陰性免疫法霍亂弧菌陰性培養法副溶血弧菌陰性培養法沙門氏菌陰性培養法志賀氏菌陰性培養法大腸埃希菌O157陰性培養法輪狀病毒抗原陰性免疫法表2長期捐獻糞便樣本捐贈人每2個月糞便樣本質量合格項目指標質量控制項目結果檢測方法菌群多樣性菌群種類數≥200種香農-威納指數>4.0測序法幽門螺桿菌陰性測序法艱難梭菌陰性測序法彎曲菌陰性測序法45.3.2.6所有項目均合格者為合格糞便樣本。標識不合格糞便樣本，標識由不合格糞便樣本制備的腸道菌群樣本為不合格腸道菌群樣本。5.3.2.7不合格糞便和腸道菌群樣本應單獨存放在不合格區，執行銷毀并記錄。5.4腸道菌群樣本5.4.1.1新鮮糞便樣本應在采集后30min內開始制備腸道菌群樣本，從糞便排出體外至菌液制作完成應保證在2h以內。5.4.1.2腸道菌群樣本制備應按照以下程序操作。a）稀釋：每次取不少于50g糞便置于一個無菌容器，加入3倍~5倍質量的無菌生理鹽水。b）攪拌：使用無菌電動攪拌器以450r/min~900r/min攪拌10min，充分混勻。d）離心：4500r/min離心5min，生物安全柜內去上清，加入400mL生理鹽水相同條件再次離心去上清。e）分裝：離心后得到的菌群沉淀可分裝成菌液、干粉膠囊或液體膠囊三種類型。1）菌液：稱量菌群沉淀重量，按1g菌群加10mL保存液的比例加入保存液，用無菌攪拌棒充分混勻為菌液，將菌液按50mL/管分裝到無菌耐低溫50mL離心管或注射器。2）干粉膠囊（平板凍干法稱量菌群沉淀重量，按1g菌群加5mL保存液的比例加入保存液，用無菌攪拌棒充分混勻為菌液。將菌液倒入無菌培養皿中，蓋好培養皿蓋，-80℃冷凍菌液2h~3h為固體后取出，打開培養皿蓋，將培養皿放入真空干燥機中干燥后取出，用無菌藥勺刮取干燥后的菌群，使用膠囊灌裝器按0.5g/粒將菌群干粉裝入羥丙甲基纖維素膠囊殼，將制作好的膠囊按需裝瓶，在瓶中加入適量干燥劑。3）干粉膠囊（旋轉凍干法稱量菌群沉淀重量，按1g菌群加5mL保存液的比例加入保存液，用無菌攪拌棒充分混勻為菌液，將菌液倒入無菌茄形瓶中，將茄形瓶置于低溫旋動儀旋轉冷凍，使菌液均勻凝固在茄形瓶內表面，后置于T型冷凍干燥機冷凍干燥，用無菌藥勺刮取干燥后的菌群，使用膠囊灌裝器按0.5g/粒將菌群干粉裝入羥丙甲基纖維素膠囊殼，將制作好的膠囊按需裝瓶，在瓶中加入適量干燥劑。4）液體膠囊：稱量菌群沉淀重量，按1g菌群加1mL保存液的比例加入保存液，用無菌攪拌棒充分混勻為菌液，使用移液器按0.5mL/粒將菌液注入明膠膠囊殼，將制作好的明膠膠囊放入羥丙甲基纖維素膠囊殼中，將制作好的膠囊按需裝瓶，在瓶中加入適量干燥劑。f）標識：貼標簽標識樣本名稱、批次、生產日期、保質期和保存條件。5.4.2質量控制5.4.2.1每批次腸道菌群樣本應留樣，用于質量控制和溯源。5.4.2.2每批次腸道菌群樣本應隨機抽樣1份按表3進行質量控制。表3每批次腸道菌群樣本質量合格項目指標質量控制項目菌液結果膠囊結果檢測方法外觀懸濁液整潔，不應有黏結、變形、滲漏或囊殼破裂目檢法活菌數不小于2.5×10個/50mL不小于1×10個/g流式細胞法細菌活性不低于80%不低于70%流式細胞法55.4.2.3腸道菌群樣本對應的父代糞便樣本按5.3.2.5質量控制有不合格項的被視為不合格腸道菌群樣本。5.4.2.4所有項目均合格者為合格樣本。標識不合格樣本，不合格樣本應單獨存放在不合格區，執行銷毀并記錄。6.1腸道菌群樣本-20℃保藏期限最長為1個月，-80℃保藏期限最長為12個月。6.2留樣的糞便和腸道菌群樣本應-80℃保存至少12個月。6.3超過保藏期限的樣本應執行銷毀并記錄。7數據管理附錄B。7.2應建立、成文并實施人類腸道菌群樣本相關數據的傳輸和接收程序，數據傳輸應確保其完整性并防止侵犯數據隱私。數據傳輸前，應就數據的采集和接收與有關各方達成工作協議。7.3人類腸道菌群樣本相關數據應經數據清洗后儲存，數據清洗包括補充完整缺失值，復核異常值，合并或刪除重復數據，以及更正不規范數據等。7.4人類腸道菌群樣本相關數據應有備份，原份和備份數據應至少保存20年。DB32/T5062—20256（資料性）布里斯托大便分類法表A.1給出了布里斯托大便分類法示意。表A.1布里斯托大便分類法示意類型圖片示例描述備注1一顆顆硬球便秘正常2像一串葡萄，表面凹凸，質地較硬3像玉米，表面有裂痕4像香腸，表面光滑，質地較軟5像雞塊，質地柔軟的半固體6像粥，無固定外形7水狀，完全液體無固體腹瀉DB32/T5062—20257（資料性）數據記錄明細B.1項目倫理批件和相關文件。B.2捐贈人數據包括捐贈人編號、知情同意書、訪談記錄、一般人口學信息、臨床診療信息、捐贈前7天的身體情況、飲食情況、用藥情況、排便情況、心理壓力情況、每次捐獻時間、每次捐贈時體溫。B.3樣本采集和接收數據包括糞便樣本編號、采集容器類型、采集時間、采集人員、糞便重量、糞便形狀和顏色、布里斯托大便分類、接收時間、接收人員。B.4樣本制備數據包括腸道菌群樣本制備方法、腸道菌群樣本編號、批次號、重量、數量、分裝后體積或膠囊數量、制備時間、制備人員。B.5樣本質量控制數據包括糞便和腸道菌群樣本質量控制檢測結果、質量控制時間、質量控制人員。B.6樣本保藏數據包括入庫時間、入庫位置、入庫人員、保藏期間溫度、出庫時間、出庫人員。B.7突發事件數據包括突發事件內容、時間、地點、處理方法、處理結果、處理人員。DB32/T5062—20258［1］史以超，王子愷，楊云生.消化道微生態標準化樣本庫共識［J］.轉化醫學雜志，2018，7（04［2］尚紅，王毓三，申子瑜.全國臨床［3］國家衛生健康委員會醫院管理研究所，中華醫學會腸外腸內營養學分會，中華醫學會腸外腸內營養學分會腸道微生態協作組.腸道菌群移植臨床應用管理中國專家共識（2022版J］.中華胃腸外科［4］中華醫學會腸外腸內營養學分會，上海預防醫學會微生態專業委員會.腸道菌群移植供體篩cn441530-20220606-002［5］郭智，王鈞，王強.中國抗癌協會腸道微生態技術整合診治指南（精簡版J］.中國腫瘤臨床，［7］中華預防醫學會醫院感染控制分會.臨床微生物標本采集和送檢指南［J］.中華醫院感染學雜［9］