專題10生物技術工程

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模板01酶切位點的選擇-既要相同又要不同

模板02雙標記篩選金標準一二去其一是為真

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朗?答題模板答題要點+答題技巧+模板運用

稼?高分突破模板綜合演練，快速技巧突破

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命題點真題在線常見設問/關鍵詞

微生物的選

2023?山東?T152023?廣東-TIO2023?北京-T162022?全國甲?T37

擇培養和計

2022?全國乙?T372022?廣東-T212021?江蘇-T18

數

2023?廣東-T122023?江蘇-T132023?浙江1月選考-T24202141

植物體細胞

M-T11

雜交技術

2020?北京?T132020?山東-T13

2023?北京?T12

動物細胞融

2023?湖北-T222022?山東-T152022?福

合和單克隆設問關鍵詞：限制酶

建.T13

抗體的制備的選擇、目的基因的

2021?山東-T152021?江蘇1112020?全國I-T38

鑒定、PCR過程

基因工程的

2023?全國乙?T382023?全國甲?T382023?湖北?T42023?廣東-T20

基本操作程

2021?廣東?T22

序

DNA片段的

2023?江蘇-T222023?山東-T252023?浙江6月選考-T192022?遼

擴增與電泳

寧?T122022?江蘇-T242021?山東-T252021?全國甲138

鑒定

幾種不同2023?江蘇-T222023?山東1252022?江蘇1242022?山東125

PCR的應用2021?全國甲T382021?山東-T252020?北京-T122020?江蘇-T33

命題預測基因表達載體的構建；標記基因的選擇

目的基因和載體的酶切和連接是設計的核心；根據題目的具體信息判斷保留和破壞的標記基

關鍵技巧

因的類型

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模板01酶切位點的選擇-既要相同又要不同

購答題要點

【核心】相同黏性末端，正確連接方向

酶切位點的選擇實際上有許多需要考慮的邏輯，但核心點是兩個：

要保證質粒和目的基因的黏性末端相同，才能讓質粒和目的基因的黏性末端相互連接。

要保證基因的頭對著啟動子，尾對著終止子，才能保證正確的轉錄。

除這兩個原則之外，很多題目還會有額外的信息，如基因中間或質粒其他位置存在相同酶切位點、同尾酶

等，要根據題目信息具體判斷。

【基本知識】

（1）限制性內切核酸酶（簡稱"限制酶"）

主要來源■原核生物

種類?分離的限制酶有數千種

特占識別雙鏈DNA分子的特定核的酸序列,

（專二Q使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵

限斷開

制

酶斷開兩個核甘酸之間的磷酸二酯鍵

［切割位置：識別序列的中心軸線兩側

黏性黑15-GAA；TTC3-_GAATTC

末埔|A之間3，CTT|AAG5，CTTAAG

結果〔切割）中立線

「切割位置：識別序列的中心軸線處

SmaIJ

平，|（在G與5，CCC|GGG3，CCCGGG

末端C之間if

回3'GGG|CCC5'GGGCCC

切割）\

中軸線

（2）限制酶的選擇

PstISmaIPst1

1i?I

SmaI抗病EcoRI

基因

甲

1.不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇Pst回，而不選擇Sma隊

2.保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所選擇的限制酶盡量

不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇Sma回。若載體上有兩個及以上的標記基因，則可合理對其中一些標記

基因進行酶切破壞，從而達到比一個標記基因更高的篩選成功率，防止只有一個標記基因時出現的"假陽

性"（即未成功導入目的基因的載體也能正常表達標記基因，造成無效篩選）。

3.善用"雙酶切"，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點時，一般需要選擇在目的基因

所在序列和載體上都存在切割位點的兩種不同的限制酶，對目的基因所在序列和載體進行剪切，即“雙酶切

法”。其優點和作用是：①防止目的基因環化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后

形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動子的方向（或描述為"RNA聚合酶的移動方向"）必須是相同的,

否則目的基因導入后無法正常表達。如圖甲、乙也可選擇PstI和EcoRI兩種限制酶。

4.巧用"同尾酶"：同尾酶指來源不同，但能產生相同黏性末端的限制酶。當不適合選擇某種限制酶時，可用

其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。

G答題技巧

技巧01酶切位點的選擇-既要相同又要不同

研究人員為尋求炎癥性疾病的高敏感檢測方法，以重組S100A8蛋白作為免疫抗原，制備了抗S100A8蛋白

的單克隆抗體。下圖是重組S100A8蛋白的制備過程，結合下表4種相關限制酶的識別序列和切割位點，可

知切割質粒的限制酶為（）

轉錄方向

（注：S100A8蛋白是炎癥反應時高度表達的一種蛋白質，可作為炎癥性疾病診斷的重要標志物。）

Hind回Neo團Bg唱Xho回

5'-A^AGCTT-3*5'-CJCATGG-3'5'-A^GATCT-3'5'-CJTCGAG-3'

A.HindIII和NcoElB.BglEI和XhoEl

C.NcolB和Xho0D.Hind回和Bgl0

【技巧點撥】【核心】相同黏性末端，正確連接方向-要保證質粒和目的基因的黏性末端相同，才能讓質粒和

目的基因的黏性末端相互連接；要保證基因的頭對著啟動子，尾對著終止子，才能保證正確的轉錄。

【思路詳解】依據題干信息，S100A8蛋白基因經切割后所產生的黏性末端為6CATG3，、5TCGA3，，依據表格

中限制酶的識別序列，可知，HindEI產生的黏性末端為5'AGCT3',NcoEl產生的黏性末端為5'CATG3'（與目的

基因一端的粘性末端能堿基互補），BglEI產生的黏性末端為5,GATC3',XhoEl產生的黏性末端為5'TCGA3,（與

目的基因另一端的粘性末端能堿基互補），為了確保目的基因和質粒的正向連接，防止自身環化，故應選擇

兩種能產生不同的黏性末端的限制酶，所以可選Neo團和Xho團進行切割質粒，C正確，ABD錯誤。

【答案】C

封模板運用

研究人員用酶M和酶N兩種限制酶同時處理某DNA分子和質粒，得到的DNA片段如圖所示。圖中DNA片

段只注明了黏性末端處的堿基種類，其他堿基的種類未注明。下列敘述錯誤的是（）

同時用酶M

某DNA分子犧迪匕飛和TGCACA和GCGCT

CACGTGTCGCGA

???????????_1

片段甲片段乙片段丙

盟用酶M和WN------------r------------r

由2處理GCGCTG*TGCACA

質粒----------------->和

ACACGTGTCGCG

Iiiiiiiiiiii

片段丁片段戊

A.該DNA分子和質粒上均含有酶M的一個切割位點和酶N的一個切割位點

B.根據圖示信息不能確定圖中形成的不同黏性末端與這兩種限制酶的對應關系

C,用T4DNA連接酶或E.coliDNA連接酶均可以將片段乙和片段丁連接起來

D.片段乙、片段丁、片段戊可依次連接形成一個環狀DNA分子

模板02雙標記篩選金標準一二去其一是為真

⑥爸題票點

【核心】失去一個標記基因的載體才是好載體

雙標記讓載體具有兩個標記性狀，如四環素抗性和青霉素抗性，在基因表達載體的構建中會破壞其中一個,

如破壞四環素抗性，含有目的基因的基因表達載體此時只有青霉素抗性，而空載體依然具有四環素抗性和

青霉素抗性，通過在培養基中添加四環素，可以區分出含有目的基因的載體和空載體。

1.標記基因的作用

載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的

能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能抵抗相

應抗生素，所以在受體細胞的培養基中加入該種抗生素就可以只保留成功轉入載體且抗生素抗性基因表達

的受體細胞。

2.雙標記原理

（1）單標記的區分問題：僅有一個標記基因時，含有目的基因的載體和空載體都有標記，在篩選時無法區

分。

（2）雙標記方法：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果目的基因插入某種抗生素抗性

基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖所示，目的基因插入了四環素抗性基因內部，則四環素

抗性基因失活。

目標值各（農合如壞案■的為永氐上

不能生畏說明次標記鼠因被破壞）

理環案抗

重組載體

細蔑含氮節青霉素含四環素

的培養基的培養基

篩選方法：將細菌先放在含氨革青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組載體的細菌和含空載體的細菌,

如圖中1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布將上述5個菌落影印到含有四環素的培養基上，如上圖,

能生長的菌落為2、3、4,則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖中1、5菌落。

最后，可在含氨茉青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。

3.標記基因的作用：在宏觀水平上看到微觀分子的變化，例如抗生素抗性基因作為標記基因時，可以用抗

生素篩選出具有抗藥性的菌落，從而快速對轉基因的結果進行鑒定。標記基因本身也是一個能正常表達的

基因，具有自己的啟動子和終止子。

4.受體細胞不同，標記基因種類也不同：受體細胞為細菌時，標記基因通常是抗生素抗性基因；受體細胞

為真核細胞，尤其是動植物細胞時，抗生素很多時候不能殺死未標記的細胞，無法起到篩選的效果，此時

標記基因通常選擇熒光基因等。

€答題技巧

技巧02失去一個標記基因的載體才是好載體

（2023?湖北?高考真題）用氨芳青霉素抗性基因（AmpR）、四環素抗性基因（TetD作為標記基因構建的質粒

如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體（重組質粒），并

轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）

A.若用Hind回酶切，目的基因轉錄的產物可能不同

B.若用Pvu回酶切，在含Tet（四環素）培養基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用Sph團酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否

D.若用Sph國酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨葦青霉素）和Tet的培養基中能形成菌落

【技巧點撥】【核心】失去一個標記基因的載體才是好載體-雙標記方法：將目的基因插入含有兩種抗生素抗

性基因的載體時，如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。

【思路詳解】A、若用Hind回酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉錄的產物可能不同，A正

確。

B、若用Pvu回酶切，重組質粒和質粒中都有四環素抗性基因（TetR）,因此在含Tet（四環素）培養基中的菌

落，不一定含有目的基因，B正確；

C、DNA凝膠電泳技術可以分離不同大小的DNA片段，重組質粒的大小與質粒不同，能夠鑒定重組質粒構

建成功與否，C正確；

D、Sph團的酶切位點位于四環素抗性基因中，若用Sph回酶切，重組質粒中含氨茶青霉素抗性基因（AmpR）,

因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨葦青霉素）的培養基中能形成菌落，在含Tet的培養基中不能形成

菌落，D錯誤。

【答案】D

業模板運用

（2023?山西?高考真題）某同學擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩

端含相應限制酶的識別序列和切割位點）和質粒進行切割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位

點如圖所示。

5'—GAATTC_3'5'—GGATCC_3'5'—CCCGGG—3'5'_AGATCT—3'

3'—CTTAAG—5'3'_CCTACp-5'3'—GGGjCCC_5f3'—TCTAGA—5(

tt

酶1酶2酶3酶4

下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是（）

A.質粒和目的基因都用酶3切割，用E.DNA連接酶連接

B.質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接

C.質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接

D.質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接

//〃/〃/〃〃//////〃/〃〃〃〃〃〃〃〃/〃〃/@裔今突破〃〃〃〃〃〃/〃〃〃/〃/〃/〃〃〃〃〃〃//〃/

1.Sau3Al和BamHI的識別序列及切割位點如表所示。某DNA分子經Sau3AEI和BamHEI分別切割以后，可形

成4個和2個大小不同的片段。下列有關敘述正確的是（）

限制酶名稱識別序列和切割位點

BamHIGJGATCC

Sau3AIJGATC

A.兩種限制酶切割后形成的黏性末端不相同

B.能被Sau3AI識另IJ的DNA位點均能被BamHI識另lj

C.該DNA分子上有2個BamH團不能識別但Sau3A團能識別的酶切位點

D.該DNA分子經Sau3AEI和BamHEI共同切割后可形成6個片段

2.大腸桿菌經溶菌酶和洗滌劑處理后，擬核DNA就會纏繞在細胞壁碎片上，靜置一段時間，質粒分布在上

清液中，利用上述原理可初步獲得質粒DNA。用三種限制酶處理提取的產物，電泳結果如圖所示。下列關

于質粒的粗提取和鑒定的敘述不正確的是（）

1限制酶I

2限制酶n

3限制酶ni

A.提取DNA時可加入酒精，使溶于酒精的蛋白質等物質溶解

B.將提取的DNA溶于2moi/LNaCI溶液后；可用二苯胺試劑進行鑒定

C.電泳鑒定DNA利用了DNA在電場中會向著它所帶電荷相反的電極移動的原理

D.根據電泳結果，質粒上一定沒有限制酶I和團的切割位點，而有限制酶團的切割位點

3.BamHLMbol>Smal三種限制酶的識別序列和切割位點依次為5'-GJGATCC-3'、5'JGATC-3'、5JCCCJGGG-3'。

下圖表示某DNA片段的部分堿基序列，已知其余序列不含這三種限制酶的識別序列。下列敘述正確的是（）

5z11111111ITMI?I?I；I111rMi111111rMi1111111113'

GGATCCCpfGGGCCCGGGGGATCC

CCTAGGGteCCCGGGCCCCCTAGG

3“山1山臼曲11山111111611111111115'

|<-------634bp--------------896bp--------*|?758bp------?|

A.若用Smal完全切割該DNA,則其產物的長度為634bp、896bp、758bp

B.若虛線方框內的堿基對被T-A替換，則用Smal完全切割該DNA可產生3種片段

C.若用Mbol和BamHI切割DNA,可形成相同的黏性末端

D.用Smal切割DNA產生的片段，可用E.coliDNA連接酶重新將其連接

4.從圖甲酶切結果分析，圖乙中目的基因（長度為2Qkb）插入方向正確的重組質粒序號和作出該判斷所

用的限制酶是（）

EcoRI

圖甲

A.②，BamHEB.①，EcoR0

C.①，EcoREI和HindEID.②，EcoRIB和HindEI

5.如圖表示利用新冠病毒包膜表面的S蛋白制備疫苗的相關過程，SUC2是酵母菌的蔗糖轉化酶基因，其表

達產物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成單糖被細胞利用，其中m、n分別是啟動子和終止子。下表中是

可供選擇使用的限制酶及其識別序列和酶切位點。據圖表推測，下列敘述錯誤的是（）

,NcoI

I

SUC2（（A））

I

Sau3AI突變型_3蛋白

BamHI酵母菌（疫苗）

目的基因S

a鏈

GATCCAF?CGGATCG??GGC

GTA-GCCTAGC…CCGGTAC5，b鏈

限制酶BamH回Nhe團Neo團Sph0Sau3A0

識別序列和酶切位點5'-GjGATCC-3'5'-GjCTAGC-3'5'-CxPCATGG-3'5'-GCATG4/C-3'5'-UGATC-3'

A.過程①所需的酶是逆轉錄酶和DNA聚合酶

B.過程②所使用的兩種限制酶是Sau3A回和Nco0

C.據圖推測，目的基因S轉錄的模板鏈最可能是b鏈

D.SUC2可作標記基因，對導入B的酵母菌進行篩選

6.下列有關實驗操作的說法，正確的是（）

A.克隆時，用Ca2+載體或蛋白酶合成抑制劑激活重構胚使其完成細胞分裂和發育進程

B.電泳時，將PCR產物與含有染色劑的凝膠載樣緩沖液混合后，加入點樣孔

C.提取DNA時，在研磨液中加入切碎的洋蔥，充分研磨后過濾，棄去上清液

D.體外受精時，用高濃度的ATP溶液處理采集到的精子使其獲能

7.由于PCR擴增出的目的基因末端為平末端，且無合適的限制酶識別序列，需借助中間載體P將目的基因

接入載體E,圖示為兩種載體的結構和相關限制酶的識別序列。下列敘述正確的是（）

—CTGCJAS---------CCctoG----------GGTAct

—CTCGAG——GATATC—

—GAGCTp——CTATAG——(^CGTC——GGG^CC——CpATGG—

XhoVEcoRVPstIS?naI'Kpnl

A.構建重組載體P時，應選擇EcoRV或Smal進行酶切，再用T,DNA連接酶連接

B.要使中間載體P接入載體E,同時防止自身環化，可選用Xhol和PstI進行酶切

C.載體P不能作為基因表達載體，因為它不含起始密碼子和終止密碼子

D.若受體細胞表現出抗性基因的相應性狀，表明重組載體成功導入受體細胞

8.如圖表示利用新冠病毒包膜表面的S蛋白制備疫苗的相關過程，SUC2是酵母菌的蔗糖轉化酶基因，其表

達產物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成單糖被細胞利用，其中m、n分別是啟動子和終止子。下表中是

可供選擇使用的限制酶及其識別序列和酶切位點。據圖表推測，下列敘述錯誤的是（）

A.過程①所需的酶是逆轉錄酶和DNA聚合酶

B.過程②所使用的兩種限制酶是Sau3A回和Nco0

C.據圖推測，目的基因S轉錄的模板鏈最可能是b鏈

D.SUC2可作標記基因，對導入B的酵母菌進行篩選

9.轉Bt基因抗蟲棉可以有效殺死棉鈴蟲，其原理是Bt基因表達的產物Bt抗蟲蛋白能與棉鈴蟲腸道上皮細

胞表面的特異性受體結合，使細胞膜穿孔，導致棉鈴蟲死亡。下列相關敘述錯誤的是（）

A.轉Bt基因抗蟲棉的培育利用的原理是基因重組

B.Bt基因在抗蟲棉細胞中表達需要經過轉錄和翻譯過程

C.培育轉基因抗蟲棉時，導入Bt基因的受體細胞不能是棉花的葉肉細胞

D.若棉鈴蟲腸道上皮細胞表面特異性受體發生改變，可能會影響抗蟲效果

10.某科研小組用PCR擴增酵母菌的rRNA基因。PCR包括多個循環，每個循環可以分為變性、退火、延伸

3個步驟。下列敘述正確的是（）

A.設計引物時需知道rRNA基因的部分序列

B.延伸時間取決于酵母菌基因組DNA的長度

C.引物濃度大小不會影響PCR擴增獲得酵母菌rRNA基因的數量

D.PCR反應前常對微量離心管進行離心以確保反應液分散于管內

11.利用PBR322質粒將人胰島素基因導入大腸桿菌（如圖1）可進行工業化生產。為檢驗基因表達載體是

否成功導入，將處理后的大腸桿菌接種在培養基上，長出的四個菌落用無菌紙分別蓋印至四種不同的培養

基上（如圖2,菌落相對位置不變），菌落生長狀況如圖所示，則成功導入基因表達載體的菌落是（）

“抗四環素基因

圖I

■?2

??

無抗生素

的培養基含氨羊青毒含四環素氨葦青霉+四環素的培養基

素的培養基的培養基

圖2

A.菌落1、2、3B.菌落1

C.菌落2、3D.菌落4

12.乙肝病毒基因工程疫苗的生產和使用流程如圖，質粒中LacZ基因可使細菌能夠利用物質X-gal,從而使

菌落呈現藍色，若無該基因，菌落則呈白色。下列敘述錯誤的是（）

A.過程①中目的基因和載體重組的效率與載體和目的基因的濃度及比例等有關

B.過程②需要在培養基中加青霉素和X-gal以獲得呈藍色的大腸桿菌菌落

C.大腸桿菌是否成功表達出乙肝病毒外殼，可用抗原一抗體雜交法進行檢測

D.該基因工程疫苗不會出現乙肝病毒感染和增殖的情況，安全性高

13.在人胰島素A鏈基因前端加入甲硫氨酸編碼序列，置于半乳糖昔酶基因（不含終止編碼序列）末端，

插入到質粒中，并轉化大腸桿菌（缺失內源性%半乳糖甘酶基因），經培養、切割和純化等得到成熟胰島素

A鏈，回答下列問題：

⑴使用限制酶和對質粒和插入DNA片段進行切割。

（2）在轉化大腸桿菌前，一般先用處理大腸桿菌細胞，使其處于容易吸收重組DNA分子的生理狀態。

⑶重組DNA分子在大腸桿菌中開始轉錄時，RNA聚合酶首先結合的位點是。

⑷將經過轉化的大腸桿菌涂布在含氨葦青霉素和X-gal的培養基中培養，若觀察到色菌落，可以確定

大腸桿菌成功表達胰島素A鏈，原因是。另一種顏色的菌落中可能不含重組DNA分子，在不考慮突變

的情況下，這些菌落不含重組DNA分子的原因是o

⑸澳化氟可以在甲硫氨酸殘基C端切割肽鏈，成熟的人胰島素A鏈不含甲硫氨酸殘基。使用澳化氟在甲硫

氨酸殘基C端切割的目的是O

14.科研人員利用圖1所示材料構建重組質粒并導入大