標記基因專題復習1標記基因的作用基因工程操作的第三步是將目的基因導入受體細胞，導入受體細胞的不是單獨的目的基因，而是載體與目的基因在限制酶和DNA連接酶的作用下形成的重組DNA分子。這一步操作中需要進行篩選，需要篩選出哪些受體細胞中導入了目的基因。篩選時需要用到與目的基因重組的載體上的標記基因，標記基因是一種已知功能或已知序列的基因，能夠起著特異性標記的作用。標記基因的作用是便于重組DNA分子的篩選，是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細胞篩選出來。例1.（2023年全國乙卷節選）構建目的基因表達載體。科研人員從構建的GFP突變基因文庫中提取目的基因（均為突變基因）構建表達載體，其模式圖如下所示（箭頭為GFP突變基因的轉錄方向）。圖中①為；②為，其作用是；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標記基因，其作用是。2標記基因的種類及篩選原理質粒等載體上常有特殊的標記基因，標記基因一般是抗生素的抗性基因，如四環素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，但是標記基因不能等同于抗性基因。高中生物學教學中標記基因的種類主要包括抗生素抗性標記基因、β-半乳糖苷酶顯色反應標記基因和營養標記基因等。2.1抗生素抗性標記基因常用的抗生素抗性標記基因主要有氨芐青霉素抗性基因（ampr）、四環素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（chlr）及卡那霉素抗性基因（kanr）等。抗生素抗性標記基因的篩選原理如下：①前提：目的基因要轉入的受體細胞如大腸桿菌（填“有”或“沒有”）抵抗相關抗生素的能力。②過程：將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，然后把受體細胞培養在含有該抗生素的培養基中。③結果：抗性基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗生素產生抗性。在培養基上，被抗生素殺死的細胞是，未被殺死的細胞是。④原理如下圖所示：例2.（2021年全國乙卷）DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征，如質粒DNA分子上有______________________，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因（如某種抗生素抗性基因），利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是。2.2β-半乳糖苷酶顯色反應標記基因某些載體，如M13噬菌體，PUC質粒系列、pGEM質粒系列等，它們的載體上都攜帶lacZ′基因一段序列，它編碼β-半乳糖苷酶的α肽，產生有生物活性的β-半乳糖苷酶，把培養基中的無色X-gal分解成半乳糖和呈藍色的5-溴-4氯-靛藍，使菌落呈藍色[1]。若將外源基因插入到載體上lacZ′序列中，使α基因失活，使α肽失活。因此攜帶空載體的大腸桿菌呈藍菌落，攜帶外源基因的大腸桿菌呈白菌落[2]。例3.圖甲為一種質粒，圖乙為含有目的基因D的DNA片段。Ap為氨芐青霉素抗性基因，lacZ′為藍色顯色基因，其表達產物可以將無色化合物X-gal轉化成藍色物質，使菌落呈藍色。EcoRⅠ、PvuⅠ為限制酶。回答下列問題：獲取目的基因D時應選擇圖乙中的_________對其所在的DNA進行切割。利用自身不含lacZ′基因且對抗生素敏感的大腸桿菌作為受體細胞，要在已轉化的含重組質粒的受體細胞、已轉化的含空質粒的受體細胞和未轉化成功的受體細胞中篩選出已轉化的含重組質粒的受體細胞的方法是。2.3營養標記基因當細胞中合成某種營養物質的酶的編碼基因失活，就成為營養缺陷型，但如果導入細胞的重組DNA分子能夠彌補缺陷的基因，培養基中就無需補充有關的營養成分。營養標記為重組體克隆的選擇提供了方便的方法[2]。例4．（2021年江蘇卷改編）URA3基因是酵母篩選標記基因，缺失該基因酵母無法合成尿嘧啶，用含有尿嘧啶的培養基培養URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導入重組質粒A-m（A為載體，上面含有URA3基因，m為目的基因），然后涂布于無尿嘧啶的培養基上，篩選獲得目的菌株，其機理是。3利用影印平板培養法進行篩選3.1只有1個標記基因時會出現“假陽性”現象若載體上只有1個標記基因,一般不能破壞其結構,否則無法在導入重組質粒后對含有重組質粒的受體細胞進行篩選。載體上只有1個標記基因時會出現“假陽性”現象，即導入了含有目的基因的重組質粒的受體細胞和導入了不含目的基因的空質粒的受體細胞都能正常表達標記基因,造成無效篩選。3.2有兩個及以上標記基因時的篩選外源DNA片段插入抗生素抗性基因內部時，將導致相應的抗性基因的失活。這種因外源DNA的插入而導致基因失活的現象，稱為插入失活[1]。若載體上有兩個及以上的標記基因,則可合理對其中一些標記基因進行酶切破壞,從而達到比只有1個標記基因更高的篩選成功率，防止只有1個標記基因時出現的“假陽性”現象。例如,載體上含有兩個不同的標記基因A和B，若目的基因插入到標記基因A內部時，會使標記基因A的結構遭到破壞而失去活性。選擇標記基因A不能正常表達而標記基因B能正常表達的受體細胞，即為成功導入了重組載體的受體細胞。此時常運用“影印平板培養法”來檢測重組載體是否導入受體細胞。例5．（2023年湖北卷）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環素抗性基因（TetR）作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體（重組質粒），并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環素）培養基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養基中能形成菌落3.3利用影印平板培養法篩選影印平板培養法是一種通過蓋印章的方式，達到在一系列培養皿平板的相同位置上出現相同遺傳型菌落的接種和培養方法[3]。影印平板培養法最初是證明抗藥性突變并非由于接觸了藥物引起的，而是突變在接觸藥物之前就已自發地隨機地產生了，藥物只是起著定向選擇作用。在基因工程中可以利用影印平板培養法檢測基因表達載體是否導入受體細胞，如下圖所示，利用EcoRⅠ和BamHⅠ兩種限制酶構建基因表達載體并且導入無青霉素和四環素抗性的大腸桿菌中，將大腸桿菌培養在含青霉素的培養基A中，形成如圖所示的6個菌落，然后利用影印平板培養法原位接種在含四環素的培養基B中，形成如圖所示的4個菌落。培養基A中的菌落就是含有重組質粒的大腸桿菌。例6.（2016年課標Ⅰ卷改編）某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環素抗性基因）。有人將此質粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化原本無Ampr和Tetr的大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。回答下列問題：1）如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含有環狀目的基因的細胞是不能區分的，其原因是；并且和的細胞也是不能區分的，其原因是。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有的固體培養基。2）上述篩選的具體步驟如下，先將大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的固體培養基上培養，得到如圖2的菌落。再將滅菌絨布按到培養基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環素的固體培養基上培養，得到如圖3的結果(空圈表示與圖2對照無菌落的位置)。圖3結果顯示，多數大腸桿菌中導入的是___________，與圖3空圈相對應的圖2中的菌落表型是___________________________________，即為含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌的單菌落。標記基因專題復習參考答案例1、鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細胞篩選出來。例2、答案：一至多個限制酶切割位點用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞例3、答案：PvuⅠ將受體細胞接種在含有氨芐青霉素和X-gal的固體培養基上培養，形