一、引言1.1研究背景與意義在合成生物學(xué)與代謝工程領(lǐng)域，微生物底盤細(xì)胞的開發(fā)與應(yīng)用是實(shí)現(xiàn)各類生物活性物質(zhì)高效生產(chǎn)的關(guān)鍵。畢赤酵母（Pichiapastoris）作為一種極具潛力的微生物底盤，近年來在異源合成領(lǐng)域展現(xiàn)出重要地位。它屬于甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有眾多優(yōu)勢(shì)，其擁有目前最強(qiáng)且調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一——醇氧化酶基因AOX1啟動(dòng)子，這使得外源基因的表達(dá)調(diào)控更加精準(zhǔn)和高效，例如在生產(chǎn)重組蛋白時(shí)，可通過甲醇誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)的精確控制。該系統(tǒng)表達(dá)水平高，既能實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)，又可進(jìn)行分泌型表達(dá)，能滿足不同研究和生產(chǎn)的需求；發(fā)酵工藝成熟且易于放大，已具備大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的能力，培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離，所用發(fā)酵培養(yǎng)基廉價(jià)且不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品的分離純化，降低了生產(chǎn)成本；外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，整合到畢赤酵母染色體上后，能隨染色體復(fù)制而穩(wěn)定存在，不易丟失；作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母還具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工，使表達(dá)出的蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，具有更高的生物活性。諸多研究成功利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了多種復(fù)雜蛋白和生物活性物質(zhì)的異源合成，如南京工業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)通過代謝工程改造巴斯德畢赤酵母成功實(shí)現(xiàn)了左旋蝦青素的異源合成，在搖瓶發(fā)酵和5L生物反應(yīng)器中均取得了較高產(chǎn)量。甜菊醇（Steviol）是一種從甜葉菊中提取的天然甜味劑，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。其甜度約為蔗糖的200-400倍，而卡路里含量卻很低，不會(huì)對(duì)血糖水平產(chǎn)生明顯影響。隨著人們健康意識(shí)的提高以及對(duì)低糖、低熱量食品需求的增加，甜菊醇作為一種天然、健康的甜味劑，在食品、飲料、保健品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在食品領(lǐng)域，它可替代傳統(tǒng)蔗糖用于各類烘焙食品、乳制品等，滿足消費(fèi)者對(duì)健康食品的需求；在飲料行業(yè)，被大量應(yīng)用于果汁、茶飲料、碳酸飲料等，為消費(fèi)者提供低熱量的甜味選擇。甜菊醇還具有一定的藥用價(jià)值，研究表明其具有抗高血壓、降低血糖、抑制癌細(xì)胞等作用。在全球范圍內(nèi)，甜菊醇市場(chǎng)規(guī)模呈現(xiàn)出穩(wěn)定增長(zhǎng)的趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年全球甜菊醇市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到了一定水平，預(yù)計(jì)到2025年將進(jìn)一步增長(zhǎng)，這表明甜菊醇市場(chǎng)正逐漸成為廣泛應(yīng)用的食品添加劑。然而，目前甜菊醇的主要生產(chǎn)方式是從甜葉菊中提取，這種方法存在諸多局限性。一方面，甜葉菊的種植受地域、氣候等自然條件限制，產(chǎn)量不穩(wěn)定，難以滿足市場(chǎng)日益增長(zhǎng)的需求；另一方面，傳統(tǒng)提取工藝復(fù)雜，成本較高，且提取過程中可能會(huì)引入雜質(zhì)，影響甜菊醇的質(zhì)量和純度。開發(fā)新的甜菊醇生產(chǎn)技術(shù)迫在眉睫。利用畢赤酵母進(jìn)行甜菊醇的異源合成具有重要意義。畢赤酵母生長(zhǎng)迅速、易于培養(yǎng)，能夠在簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基中快速繁殖，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，從而有效解決甜菊醇產(chǎn)量不足的問題；通過對(duì)畢赤酵母進(jìn)行基因工程改造和代謝途徑優(yōu)化，可以精確調(diào)控甜菊醇的合成過程，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品純度，降低生產(chǎn)成本；利用畢赤酵母異源合成甜菊醇還可以減少對(duì)甜葉菊種植的依賴，降低對(duì)環(huán)境的影響，符合可持續(xù)發(fā)展的理念。本研究致力于開發(fā)和優(yōu)化畢赤酵母中甜菊醇的異源合成技術(shù)，旨在為甜菊醇的高效、可持續(xù)生產(chǎn)提供新的方法和策略，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)概述畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種在生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有諸多獨(dú)特的特點(diǎn)和顯著優(yōu)勢(shì)，在蛋白表達(dá)和小分子化學(xué)品合成等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。從細(xì)胞特性來看，畢赤酵母屬于甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，能夠以甲醇作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝。在甲醇的誘導(dǎo)下，畢赤酵母會(huì)啟動(dòng)一系列與甲醇代謝相關(guān)的基因表達(dá)，其中最具代表性的是醇氧化酶基因（AOX1）。AOX1啟動(dòng)子是目前已知最強(qiáng)且調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一，這一特性使得畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在調(diào)控外源基因表達(dá)方面具有高度的精準(zhǔn)性和有效性。當(dāng)以甲醇為唯一碳源時(shí)，AOX1啟動(dòng)子可被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，驅(qū)動(dòng)外源基因高效表達(dá)；而在其他碳源（如甘油、葡萄糖）存在時(shí)，AOX1啟動(dòng)子則受到抑制，外源基因的表達(dá)被嚴(yán)格控制，這種精確的調(diào)控機(jī)制為外源蛋白的生產(chǎn)提供了有力保障。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)十分突出。在表達(dá)水平方面，它表現(xiàn)卓越，既能實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)，也可進(jìn)行分泌型表達(dá)。胞內(nèi)表達(dá)適合對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)完整性要求較高、不需要分泌到胞外環(huán)境的蛋白生產(chǎn)；而分泌型表達(dá)則便于蛋白的分離和純化，因?yàn)榉置诘脚囵B(yǎng)基中的蛋白更容易與細(xì)胞內(nèi)其他成分分離。該系統(tǒng)表達(dá)水平高，許多研究都成功實(shí)現(xiàn)了高水平的外源蛋白表達(dá)，如在某些研究中，利用畢赤酵母表達(dá)特定的酶，其表達(dá)量可達(dá)每升數(shù)克甚至更高。發(fā)酵工藝成熟且易于放大是其另一大優(yōu)勢(shì)，畢赤酵母已具備大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的能力。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的研究基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，如溫度、pH值、溶氧、碳氮源比例等，可以順利將發(fā)酵過程從搖瓶培養(yǎng)放大到生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。這一特性使得畢赤酵母在工業(yè)生產(chǎn)中具有極大的應(yīng)用潛力，能夠滿足市場(chǎng)對(duì)大量目標(biāo)蛋白或小分子化學(xué)品的需求。在成本方面，畢赤酵母具有明顯的優(yōu)勢(shì)。其培養(yǎng)成本低，所用發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單且廉價(jià)，主要包含一些無機(jī)鹽、碳源和氮源，并且培養(yǎng)基中不含蛋白，這有利于下游產(chǎn)品的分離純化，降低了生產(chǎn)成本。例如，在生產(chǎn)過程中，無需復(fù)雜的分離步驟去除培養(yǎng)基中的蛋白雜質(zhì)，減少了生產(chǎn)環(huán)節(jié)和成本支出。此外，畢赤酵母的外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，整合到畢赤酵母染色體上的外源基因，會(huì)隨著染色體的復(fù)制而穩(wěn)定存在，不易丟失，這保證了在多次傳代培養(yǎng)過程中，外源基因的表達(dá)穩(wěn)定性，有利于長(zhǎng)期穩(wěn)定的生產(chǎn)。作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這使得它能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白進(jìn)行多種翻譯后修飾加工，如糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等。這些修飾對(duì)于許多蛋白的正確折疊、穩(wěn)定性和生物活性至關(guān)重要。例如，糖基化修飾可以影響蛋白的溶解度、免疫原性和半衰期，使表達(dá)出的蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，具有更高的生物活性。在一些藥用蛋白的生產(chǎn)中，畢赤酵母的這種翻譯后修飾能力能夠確保蛋白的質(zhì)量和療效，使其更適合臨床應(yīng)用。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛。在蛋白表達(dá)領(lǐng)域，它被用于生產(chǎn)各種重組蛋白，包括藥用蛋白、工業(yè)酶、抗體等。在醫(yī)藥領(lǐng)域，許多重要的藥用蛋白如胰島素、生長(zhǎng)激素、干擾素等都可以利用畢赤酵母進(jìn)行高效表達(dá)，為藥物研發(fā)和生產(chǎn)提供了新的途徑。在工業(yè)酶生產(chǎn)中，畢赤酵母可用于表達(dá)多種酶類，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，這些酶在食品加工、紡織、洗滌劑等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用。在小分子化學(xué)品合成方面，畢赤酵母也展現(xiàn)出巨大的潛力。通過對(duì)畢赤酵母的代謝途徑進(jìn)行改造和優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)多種小分子化學(xué)品的異源合成，如前文提到的南京工業(yè)大學(xué)團(tuán)隊(duì)利用畢赤酵母成功合成左旋蝦青素，以及一些研究通過畢赤酵母合成萜類化合物、有機(jī)酸等。這些小分子化學(xué)品在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。1.3甜菊醇的研究現(xiàn)狀甜菊醇，化學(xué)名為(14-alpha)-13-Hydroxykaur-16-en-18-oicacid，其分子式為C_{20}H_{30}O_{3}，分子量為318.4504。從結(jié)構(gòu)上看，甜菊醇屬于貝殼杉烯型四環(huán)二萜類化合物，具有獨(dú)特的四環(huán)骨架結(jié)構(gòu)，包含四個(gè)環(huán)（A、B、C、D環(huán)），在13位上連接有一個(gè)羥基，18位為羧基，這種特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了甜菊醇一系列獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)。其性狀為純白色結(jié)晶粉末，相對(duì)密度約為1.17g/cm3，熔點(diǎn)達(dá)到215°C，可溶于甲醇、乙醇、DMSO等有機(jī)溶劑，在水中的溶解性相對(duì)較差。在生物活性方面，甜菊醇展現(xiàn)出多種有益的功效。研究表明，甜菊醇具有抗高血壓的作用，它能夠通過調(diào)節(jié)血管緊張素系統(tǒng)，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的活性，從而降低血管緊張素Ⅱ的生成，使血管舒張，血壓下降。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究都證實(shí)了這一作用，如在對(duì)高血壓大鼠模型的實(shí)驗(yàn)中，給予甜菊醇干預(yù)后，大鼠的血壓得到了顯著降低。甜菊醇還具有降低血糖的功效，它可以通過提高胰島素的敏感性，促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用，降低血糖水平。在一些糖尿病小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，甜菊醇能夠改善小鼠的糖耐量，降低血糖峰值。甜菊醇還被發(fā)現(xiàn)具有抑制癌細(xì)胞的作用，它可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究表明，甜菊醇能夠影響癌細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗癌作用。由于其獨(dú)特的生物活性和低熱量、高甜度的特點(diǎn)，甜菊醇在多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在食品領(lǐng)域，甜菊醇作為一種天然甜味劑，被大量應(yīng)用于各類食品的生產(chǎn)中。在飲料行業(yè)，它可用于果汁、茶飲料、碳酸飲料等，為消費(fèi)者提供低熱量的甜味選擇，滿足了人們對(duì)健康飲品的需求；在烘焙食品中，甜菊醇可替代傳統(tǒng)蔗糖，用于制作面包、蛋糕、餅干等，既能保持食品的甜味，又能降低熱量攝入，符合健康飲食的趨勢(shì)；在乳制品中，如酸奶、牛奶等，添加甜菊醇可以增加甜味，同時(shí)減少糖分的使用，更適合糖尿病患者和關(guān)注健康的消費(fèi)者。在醫(yī)藥領(lǐng)域，甜菊醇的藥用價(jià)值也逐漸受到重視。除了上述提到的抗高血壓、降低血糖和抑制癌細(xì)胞的作用外，甜菊醇還具有抗炎、抗氧化等功效，可用于開發(fā)治療相關(guān)疾病的藥物。在保健品領(lǐng)域，甜菊醇常被用于制作減肥、降血糖、降血壓等功能性保健品，幫助人們維持健康的身體狀態(tài)。目前，甜菊醇的主要生產(chǎn)方式是從甜葉菊中提取。這種傳統(tǒng)的提取方法存在諸多不足之處。從種植環(huán)節(jié)來看，甜葉菊的種植對(duì)地域和氣候條件要求較為苛刻。它適宜在溫暖、濕潤(rùn)且陽光充足的環(huán)境中生長(zhǎng)，對(duì)土壤的酸堿度、肥力等也有一定要求，這使得甜葉菊的種植范圍受到限制，主要集中在一些特定的地區(qū)，如中國(guó)的江蘇、安徽等地，以及巴西、巴拉圭等國(guó)家。氣候條件的變化，如干旱、洪澇、極端溫度等，會(huì)對(duì)甜葉菊的生長(zhǎng)和產(chǎn)量產(chǎn)生顯著影響，導(dǎo)致甜葉菊的產(chǎn)量不穩(wěn)定，難以滿足市場(chǎng)日益增長(zhǎng)的需求。從提取工藝角度分析，傳統(tǒng)的提取工藝較為復(fù)雜，通常需要經(jīng)過采摘、晾曬、粉碎、浸提、分離、純化等多個(gè)步驟。在浸提過程中，需要使用大量的溶劑，如乙醇、水等，且提取效率較低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高。提取過程中可能會(huì)引入雜質(zhì)，如植物纖維、色素、其他次生代謝產(chǎn)物等，這些雜質(zhì)會(huì)影響甜菊醇的質(zhì)量和純度，增加了后續(xù)分離純化的難度和成本。為了獲得高純度的甜菊醇，往往需要采用多種分離技術(shù)，如柱層析、結(jié)晶等，進(jìn)一步增加了生產(chǎn)的復(fù)雜性和成本。因此，開發(fā)新的甜菊醇生產(chǎn)技術(shù)，如利用畢赤酵母進(jìn)行異源合成，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。二、畢赤酵母中甜菊醇異源合成技術(shù)的開發(fā)2.1相關(guān)基因與代謝途徑解析2.1.1甜菊醇生物合成途徑關(guān)鍵基因甜菊醇的生物合成是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過程，涉及一系列酶催化的反應(yīng)，這些反應(yīng)在植物細(xì)胞內(nèi)有條不紊地進(jìn)行，共同構(gòu)建出甜菊醇獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)。其生物合成途徑起始于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（MVA）途徑和質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑，這兩條途徑是萜類化合物合成的基礎(chǔ)，它們負(fù)責(zé)生成重要的前體物質(zhì)——異戊烯基焦磷酸（IPP）及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。在酶的作用下，IPP和DMAPP逐步縮合，最終形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP），GGPP作為關(guān)鍵的前體，是后續(xù)甜菊醇合成的重要起始物質(zhì)。從GGPP開始，甜菊醇的合成進(jìn)入了關(guān)鍵的四環(huán)二萜合成階段。在這個(gè)階段，古巴焦磷酸合酶（CPPS）首先發(fā)揮作用，它催化GGPP環(huán)化形成古巴焦磷酸（CPP），CPP是合成四環(huán)二萜骨架的重要中間體。緊接著，貝殼杉烯合成酶（KS）以CPP為底物，通過一系列復(fù)雜的催化反應(yīng)，將CPP轉(zhuǎn)化為貝殼杉烯，貝殼杉烯的形成標(biāo)志著甜菊醇四環(huán)二萜骨架的初步構(gòu)建。貝殼杉烯合成酶（KS）在甜菊醇生物合成中起著不可或缺的作用，它是四環(huán)二萜骨架合成的關(guān)鍵酶，其基因表達(dá)水平和酶活性直接影響著甜菊醇的合成效率。研究表明，通過基因工程手段提高KS基因的表達(dá)量，能夠顯著增加貝殼杉烯的產(chǎn)量，進(jìn)而促進(jìn)甜菊醇的合成。例如，在某些植物基因工程研究中，將KS基因?qū)肽繕?biāo)植物并使其過表達(dá)，結(jié)果顯示甜菊醇的前體物質(zhì)貝殼杉烯的含量大幅提高，為后續(xù)甜菊醇的合成提供了更充足的原料。貝殼杉烯形成后，需要經(jīng)過一系列氧化反應(yīng)才能逐步轉(zhuǎn)化為甜菊醇。貝殼杉烯氧化酶（KO）是這一過程中的關(guān)鍵酶，它屬于細(xì)胞色素P450單加氧酶家族，能夠催化貝殼杉烯發(fā)生三步連續(xù)的氧化反應(yīng)，依次將貝殼杉烯轉(zhuǎn)化為貝殼杉烯醇、貝殼杉烯醛和貝殼杉烯酸。這三步氧化反應(yīng)逐步改變了貝殼杉烯的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其向甜菊醇的結(jié)構(gòu)逐漸靠攏。貝殼杉烯酸在后續(xù)的反應(yīng)中，還會(huì)在其他酶的作用下進(jìn)一步氧化和修飾，最終形成甜菊醇。貝殼杉烯氧化酶（KO）的催化活性和選擇性對(duì)甜菊醇的合成至關(guān)重要，它決定了氧化反應(yīng)的速率和產(chǎn)物的特異性。如果KO的活性受到抑制或其基因表達(dá)量降低，甜菊醇的合成將受到嚴(yán)重阻礙。例如，在一些基因沉默實(shí)驗(yàn)中，通過抑制KO基因的表達(dá)，甜菊醇的產(chǎn)量顯著下降，這充分說明了KO在甜菊醇生物合成途徑中的關(guān)鍵地位。除了上述關(guān)鍵酶基因外，甜菊醇生物合成途徑中還涉及其他一些酶基因，它們共同協(xié)作，確保甜菊醇的合成能夠順利進(jìn)行。這些酶基因的表達(dá)和調(diào)控相互關(guān)聯(lián)，形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同維持著甜菊醇生物合成的平衡和穩(wěn)定。例如，某些酶基因的表達(dá)可能受到上游調(diào)控因子的影響，而這些調(diào)控因子又可能與其他代謝途徑相互作用，從而影響整個(gè)甜菊醇生物合成途徑的效率和產(chǎn)量。對(duì)甜菊醇生物合成途徑關(guān)鍵基因的深入研究，有助于我們從分子層面理解甜菊醇的合成機(jī)制，為利用畢赤酵母進(jìn)行甜菊醇的異源合成提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。通過對(duì)這些關(guān)鍵基因的功能解析和調(diào)控研究，我們可以有針對(duì)性地對(duì)畢赤酵母進(jìn)行基因工程改造，優(yōu)化甜菊醇的合成途徑，提高甜菊醇的產(chǎn)量和質(zhì)量。2.1.2畢赤酵母內(nèi)源代謝途徑對(duì)甜菊醇合成的影響畢赤酵母作為一種重要的微生物底盤細(xì)胞，其內(nèi)源代謝途徑十分復(fù)雜，這些代謝途徑相互交織，構(gòu)成了一個(gè)龐大而有序的代謝網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，各個(gè)代謝途徑之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同維持著畢赤酵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)。當(dāng)利用畢赤酵母進(jìn)行甜菊醇的異源合成時(shí)，畢赤酵母的內(nèi)源代謝途徑會(huì)對(duì)甜菊醇的合成產(chǎn)生多方面的影響，深入了解這些影響對(duì)于優(yōu)化甜菊醇的異源合成工藝具有重要意義。從碳代謝途徑來看，畢赤酵母主要通過糖酵解途徑（EMP）、磷酸戊糖途徑（PPP）和三羧酸循環(huán)（TCA）來實(shí)現(xiàn)對(duì)碳源的利用和能量的產(chǎn)生。在以葡萄糖為碳源的情況下，葡萄糖首先通過EMP途徑被分解為丙酮酸，丙酮酸一部分進(jìn)入TCA循環(huán)，進(jìn)一步氧化分解產(chǎn)生能量和中間代謝產(chǎn)物；另一部分則可能通過其他途徑進(jìn)行代謝。PPP途徑則主要參與產(chǎn)生還原力（NADPH）和一些重要的中間代謝產(chǎn)物，如核糖-5-磷酸等。這些碳代謝途徑產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，如丙酮酸、乙酰輔酶A等，是甜菊醇生物合成的重要前體物質(zhì)。乙酰輔酶A是MVA途徑和MEP途徑的起始物質(zhì)，它在萜類化合物的合成中起著關(guān)鍵作用。畢赤酵母內(nèi)源碳代謝途徑的流量分配會(huì)直接影響到這些前體物質(zhì)的供應(yīng)。如果碳代謝途徑的流量主要流向TCA循環(huán)，用于產(chǎn)生能量，那么用于甜菊醇合成的前體物質(zhì)供應(yīng)可能會(huì)不足，從而限制甜菊醇的合成。通過優(yōu)化碳源種類和濃度，以及調(diào)節(jié)相關(guān)代謝途徑的關(guān)鍵酶活性，可以改變碳代謝途徑的流量分配，提高前體物質(zhì)的供應(yīng)，促進(jìn)甜菊醇的合成。在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)適當(dāng)提高葡萄糖的濃度，并調(diào)節(jié)EMP途徑中關(guān)鍵酶的活性時(shí)，丙酮酸和乙酰輔酶A的產(chǎn)量增加，進(jìn)而促進(jìn)了甜菊醇前體物質(zhì)的合成，提高了甜菊醇的產(chǎn)量。畢赤酵母的氮代謝途徑也會(huì)對(duì)甜菊醇合成產(chǎn)生影響。氮源是畢赤酵母生長(zhǎng)和代謝所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要參與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的合成。在氮代謝過程中，畢赤酵母通過吸收外界的氮源，如銨鹽、硝酸鹽等，將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的氨基酸、核苷酸等物質(zhì)。氮源的種類和濃度會(huì)影響畢赤酵母的生長(zhǎng)速率和代謝活性。如果氮源供應(yīng)不足，畢赤酵母的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，從而影響到甜菊醇合成相關(guān)基因的表達(dá)和酶的活性。氮代謝途徑中的一些中間產(chǎn)物，如谷氨酰胺、谷氨酸等，也可能參與到甜菊醇合成途徑中某些酶的調(diào)節(jié)。適當(dāng)控制氮源的種類和濃度，維持氮代謝的平衡，對(duì)于甜菊醇的合成至關(guān)重要。研究表明，在培養(yǎng)基中添加適量的有機(jī)氮源，如酵母提取物，可以提高畢赤酵母的生長(zhǎng)速率和代謝活性，促進(jìn)甜菊醇合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高甜菊醇的產(chǎn)量。在脂質(zhì)代謝方面，畢赤酵母能夠合成和利用各種脂質(zhì)，包括脂肪酸、甘油三酯等。脂質(zhì)代謝途徑與甜菊醇合成途徑存在一定的關(guān)聯(lián)。脂肪酸的合成需要乙酰輔酶A作為前體物質(zhì)，這與甜菊醇合成的前體物質(zhì)來源相同。如果脂質(zhì)代謝途徑過于活躍，消耗了大量的乙酰輔酶A，那么用于甜菊醇合成的乙酰輔酶A就會(huì)減少，從而影響甜菊醇的合成。通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝途徑中的關(guān)鍵酶，如脂肪酸合成酶等，可以減少乙酰輔酶A的不必要消耗，提高其在甜菊醇合成途徑中的利用率。在一些研究中，通過基因工程手段敲低脂肪酸合成酶基因的表達(dá)，減少了脂肪酸的合成，使得更多的乙酰輔酶A能夠用于甜菊醇的合成，從而提高了甜菊醇的產(chǎn)量。畢赤酵母的內(nèi)源代謝途徑還會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)和氧化還原平衡。甜菊醇的合成是一個(gè)耗能過程，需要充足的能量供應(yīng)。畢赤酵母通過細(xì)胞呼吸產(chǎn)生的ATP為甜菊醇合成提供能量。如果細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)不佳，ATP供應(yīng)不足，甜菊醇的合成將受到影響。細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡也會(huì)影響甜菊醇合成相關(guān)酶的活性。例如，一些細(xì)胞色素P450酶在催化反應(yīng)時(shí)需要合適的氧化還原環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)失衡可能會(huì)導(dǎo)致這些酶的活性降低，進(jìn)而影響甜菊醇的合成。維持畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)良好的能量狀態(tài)和氧化還原平衡，對(duì)于甜菊醇的異源合成至關(guān)重要。可以通過優(yōu)化發(fā)酵條件，如控制溶氧、調(diào)節(jié)碳氮比等，來維持細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)和氧化還原平衡，促進(jìn)甜菊醇的合成。在發(fā)酵過程中，適當(dāng)提高溶氧水平，可以增加細(xì)胞的呼吸作用，產(chǎn)生更多的ATP，為甜菊醇合成提供充足的能量；同時(shí)，調(diào)節(jié)碳氮比可以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，保證甜菊醇合成相關(guān)酶的活性，從而提高甜菊醇的產(chǎn)量。2.2基因工程技術(shù)在甜菊醇異源合成中的應(yīng)用2.2.1目的基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建從植物中克隆甜菊醇合成關(guān)鍵基因是實(shí)現(xiàn)畢赤酵母中甜菊醇異源合成的首要步驟，這一過程涉及復(fù)雜的分子生物學(xué)技術(shù)和精細(xì)的操作流程。以甜葉菊為例，首先需要從新鮮的甜葉菊葉片中提取高質(zhì)量的總RNA。在提取過程中，通常采用改良的CTAB法或商業(yè)化的RNA提取試劑盒，這些方法能夠有效去除植物組織中的多糖、多酚等雜質(zhì)，確保提取的RNA完整性和純度。通過紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測(cè)，保證其A260/A280比值在1.8-2.0之間，且在凝膠電泳中呈現(xiàn)清晰的28S和18SrRNA條帶，表明RNA無明顯降解。獲得高質(zhì)量的總RNA后，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程中，選擇合適的引物至關(guān)重要，通常采用oligo(dT)引物或隨機(jī)引物，以確保能夠全面地逆轉(zhuǎn)錄各種mRNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中包含RNA模板、引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、緩沖液等成分，在適宜的溫度和時(shí)間條件下進(jìn)行反應(yīng)，一般在42℃反應(yīng)60分鐘左右，然后通過70℃加熱10分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。以cDNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增甜菊醇合成關(guān)鍵基因，如古巴焦磷酸合酶（CPPS）基因、貝殼杉烯合成酶（KS）基因、貝殼杉烯氧化酶（KO）基因等。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，需根據(jù)目標(biāo)基因的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并在引物兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便后續(xù)與表達(dá)載體進(jìn)行連接。引物設(shè)計(jì)還需考慮引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等因素，以確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等，反應(yīng)條件通常為94℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30秒、55-65℃退火30秒、72℃延伸1-2分鐘，最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶。表達(dá)載體的構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)目的基因在畢赤酵母中有效表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。常用的畢赤酵母表達(dá)載體包括pPIC9K、pPICZαA等，這些載體具有多種元件，以確保目的基因的穩(wěn)定表達(dá)和篩選。啟動(dòng)子是表達(dá)載體中的重要元件，它能夠啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過程。在畢赤酵母中，醇氧化酶基因AOX1啟動(dòng)子是最常用的強(qiáng)啟動(dòng)子之一，它具有嚴(yán)格的甲醇誘導(dǎo)調(diào)控特性。在甲醇存在的條件下，AOX1啟動(dòng)子被激活，驅(qū)動(dòng)目的基因高效表達(dá)；而在其他碳源存在時(shí)，AOX1啟動(dòng)子受到抑制，目的基因表達(dá)水平較低。選擇AOX1啟動(dòng)子可以精確控制甜菊醇合成關(guān)鍵基因的表達(dá)時(shí)機(jī)和水平，有利于提高甜菊醇的合成效率。終止子也是表達(dá)載體不可或缺的元件，它能夠終止基因轉(zhuǎn)錄，防止轉(zhuǎn)錄過程過度延伸。常用的終止子如CYC1終止子，它具有高效的終止轉(zhuǎn)錄能力，能夠確保轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的完整性和穩(wěn)定性。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，將終止子置于目的基因的下游，保證基因轉(zhuǎn)錄的正常終止。篩選標(biāo)記是用于篩選陽性轉(zhuǎn)化子的重要元件。常用的篩選標(biāo)記包括抗生素抗性基因和營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因。抗生素抗性基因如Zeocin抗性基因、G418抗性基因等，能夠使轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母細(xì)胞在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則無法存活。營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因則利用畢赤酵母某些營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的特性，如組氨酸缺陷型菌株（his4-），通過在表達(dá)載體中引入組氨酸合成基因（HIS4），使轉(zhuǎn)化后的菌株能夠在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和畢赤酵母菌株的特性選擇合適的篩選標(biāo)記，確保能夠準(zhǔn)確篩選出含有重組表達(dá)載體的畢赤酵母細(xì)胞。將擴(kuò)增得到的甜菊醇合成關(guān)鍵基因與表達(dá)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。通常采用限制性內(nèi)切酶雙酶切法，將目的基因和表達(dá)載體分別用相同的兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，然后通過T4DNA連接酶將酶切后的目的基因片段和線性化的表達(dá)載體連接起來。連接反應(yīng)在16℃下進(jìn)行過夜，使目的基因與表達(dá)載體充分連接。連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增和篩選，挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證，確保重組表達(dá)載體中目的基因的序列正確且連接無誤。2.2.2畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與篩選將重組表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母是實(shí)現(xiàn)甜菊醇異源合成的關(guān)鍵步驟，常用的轉(zhuǎn)化方法包括電轉(zhuǎn)化法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法，其中電轉(zhuǎn)化法因其較高的轉(zhuǎn)化效率而被廣泛應(yīng)用。在進(jìn)行電轉(zhuǎn)化前，需要制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。首先挑取畢赤酵母單菌落接種至含有5mlYPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，在30℃、250-300r/min的條件下培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取100-500μl培養(yǎng)物接種至含有50ml新鮮YPD培養(yǎng)基的200mL三角搖瓶中，繼續(xù)在28-30℃、250-300r/min的條件下培養(yǎng)過夜，直至細(xì)胞密度OD600達(dá)到1.3-1.5。此時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，具有較高的轉(zhuǎn)化活性。將培養(yǎng)好的細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃、1500g離心5min，收集菌體沉淀。用50ml冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸，再次離心后，用25ml冰預(yù)冷的無菌水重懸菌體，重復(fù)此步驟，以充分洗滌細(xì)胞，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。最后用2-5ml1M冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，再次離心后，用160μl冰預(yù)冷的1mol山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，得到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，其終體積約為240ul。感受態(tài)細(xì)胞制備完成后，可將其分裝為80μl一份，于-70℃冷凍保存，但需注意保存時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以免影響轉(zhuǎn)化效率。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體用SalI等限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理，以提高轉(zhuǎn)化效率。線性化后的重組表達(dá)載體用乙醇沉淀法進(jìn)行純化，去除酶切反應(yīng)體系中的雜質(zhì)。將5-20μg線性化的DNA溶解在5-10μlTE溶液中，與80μl制備好的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞充分混勻，轉(zhuǎn)移至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中。將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min，使細(xì)胞與DNA充分結(jié)合。根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀的說明書，參考相關(guān)文獻(xiàn)及多次實(shí)驗(yàn)摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，一般推薦電壓為1.5kV，電容為25μF，電阻為200Ω。按優(yōu)化的參數(shù)進(jìn)行電擊，電擊時(shí)間通常為4-10msec。電擊完畢后，馬上加入1ml1M冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中。將菌體懸液涂布于MD平板上，每200-600μl涂布一塊平板。將平板置于30℃倒置培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)，一般需要3-4天。篩選陽性轉(zhuǎn)化子是確保獲得能夠合成甜菊醇的畢赤酵母菌株的重要環(huán)節(jié)。基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)的篩選策略是常用的方法之一。以組氨酸缺陷型畢赤酵母菌株（如GS115）為例，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入該菌株后，若重組載體成功整合到畢赤酵母基因組中，且攜帶的組氨酸合成基因（HIS4）能夠正常表達(dá)，轉(zhuǎn)化后的菌株則能夠在不含組氨酸的MD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化的菌株由于缺乏組氨酸合成能力，無法在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。通過這種方式，可以初步篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。基于抗生素抗性的篩選策略也被廣泛應(yīng)用。若重組表達(dá)載體中攜帶抗生素抗性基因，如Zeocin抗性基因，將轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母細(xì)胞涂布在含有相應(yīng)抗生素（如Zeocin）的培養(yǎng)基上，只有成功轉(zhuǎn)化并表達(dá)抗生素抗性基因的菌株能夠存活并形成菌落，而未轉(zhuǎn)化的菌株則被抗生素抑制生長(zhǎng)。通過這種方法，可以高效地篩選出含有重組表達(dá)載體的陽性轉(zhuǎn)化子。為了進(jìn)一步驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子中重組表達(dá)載體的整合情況和目的基因的表達(dá)情況，還需要進(jìn)行PCR復(fù)篩和其他檢測(cè)。利用5’AOX1和3’AOX1引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若重組質(zhì)粒以單交換的方式整合到畢赤酵母基因組中，則會(huì)擴(kuò)增到兩條帶，一條為宿主菌AOX1基因，另一條為包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信號(hào)肽序列的片段。通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，可以判斷重組表達(dá)載體是否成功整合到畢赤酵母基因組中。還可以通過SDS-PAGE、Western-Blot等方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況，以及利用高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）等技術(shù)檢測(cè)甜菊醇的合成情況，確保篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子能夠高效合成甜菊醇。2.3發(fā)酵工藝的初步建立2.3.1培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化培養(yǎng)基作為畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的物質(zhì)基礎(chǔ)，其成分的選擇和優(yōu)化對(duì)于整個(gè)發(fā)酵過程至關(guān)重要。不同的培養(yǎng)基成分會(huì)顯著影響畢赤酵母的生長(zhǎng)狀況、代謝活性以及甜菊醇的合成效率。在畢赤酵母的發(fā)酵過程中，常用的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（BSM）、酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）、緩沖甘油復(fù)合培養(yǎng)基（BMGY）和緩沖甲醇復(fù)合培養(yǎng)基（BMMY）等，它們各自具有獨(dú)特的成分和特點(diǎn)，對(duì)畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇合成產(chǎn)生不同的影響。基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（BSM）是一種常用的合成培養(yǎng)基，主要成分包括磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鈣、硫酸銨等無機(jī)鹽，以及生物素等微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。BSM培養(yǎng)基成分明確，有利于精確控制發(fā)酵過程中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，便于研究人員深入探究各成分對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的影響。由于其營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)簡(jiǎn)單，在單獨(dú)使用時(shí)，可能無法滿足畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的全部需求。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，僅使用BSM培養(yǎng)基培養(yǎng)畢赤酵母，其細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，甜菊醇的合成量也較低。為了改善這種情況，通常會(huì)在BSM培養(yǎng)基中添加其他營(yíng)養(yǎng)成分，如碳源、氮源等，以優(yōu)化培養(yǎng)基配方。酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）是一種富含多種營(yíng)養(yǎng)成分的復(fù)合培養(yǎng)基，其中酵母提取物提供了豐富的氨基酸、維生素和核苷酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，蛋白胨則為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了氮源和多肽，葡萄糖作為速效碳源，能夠快速被畢赤酵母利用，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖。在YPD培養(yǎng)基中，畢赤酵母能夠快速生長(zhǎng)，細(xì)胞密度迅速增加。這種培養(yǎng)基也存在一些不足之處，由于其營(yíng)養(yǎng)成分較為復(fù)雜，可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過程中的代謝副產(chǎn)物增多，影響甜菊醇的合成和分離純化。在利用YPD培養(yǎng)基進(jìn)行甜菊醇合成時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生較多的有機(jī)酸、醇類等代謝副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物不僅會(huì)消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可能對(duì)甜菊醇的合成產(chǎn)生抑制作用。在使用YPD培養(yǎng)基時(shí)，需要對(duì)其成分進(jìn)行優(yōu)化，或者與其他培養(yǎng)基配合使用，以提高甜菊醇的合成效率。緩沖甘油復(fù)合培養(yǎng)基（BMGY）和緩沖甲醇復(fù)合培養(yǎng)基（BMMY）在畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)甜菊醇的過程中起著關(guān)鍵作用。BMGY培養(yǎng)基主要用于畢赤酵母的生長(zhǎng)階段，其成分除了含有酵母提取物、蛋白胨等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還添加了甘油作為碳源。甘油是一種較為溫和的碳源，能夠?yàn)楫叧嘟湍傅纳L(zhǎng)提供穩(wěn)定的能量供應(yīng)，同時(shí)不會(huì)像葡萄糖那樣引起快速的代謝變化。在BMGY培養(yǎng)基中，畢赤酵母能夠平穩(wěn)地生長(zhǎng)，積累足夠的生物量，為后續(xù)的甜菊醇合成階段奠定基礎(chǔ)。當(dāng)畢赤酵母生長(zhǎng)到一定階段后，需要切換到BMMY培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。BMMY培養(yǎng)基以甲醇作為唯一碳源，同時(shí)添加了適量的緩沖劑，以維持培養(yǎng)基的pH穩(wěn)定。在甲醇的誘導(dǎo)下，畢赤酵母的醇氧化酶基因（AOX1）被激活，啟動(dòng)甜菊醇合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)甜菊醇的合成。甲醇的添加量和添加方式對(duì)甜菊醇的合成效率有著重要影響。如果甲醇添加量過少，可能無法充分誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子，導(dǎo)致甜菊醇合成量較低；而如果甲醇添加量過多，則可能對(duì)畢赤酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒性，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。為了優(yōu)化培養(yǎng)基配方，提高畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇的合成效率，通常采用響應(yīng)面法等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。響應(yīng)面法是一種基于數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它能夠同時(shí)考慮多個(gè)因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)變量（如甜菊醇產(chǎn)量、細(xì)胞生長(zhǎng)速率等）的影響。通過設(shè)計(jì)一系列的實(shí)驗(yàn)組合，建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)模型進(jìn)行分析和優(yōu)化，從而確定最佳的培養(yǎng)基配方。在研究碳源、氮源和無機(jī)鹽對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的影響時(shí)，可以將葡萄糖、甘油、酵母提取物、蛋白胨、磷酸二氫鉀等作為自變量，甜菊醇產(chǎn)量和細(xì)胞生長(zhǎng)速率作為響應(yīng)變量，利用響應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，建立二次回歸模型，分析各因素之間的交互作用，并通過模型預(yù)測(cè)確定最佳的培養(yǎng)基配方。在實(shí)際操作中，還可以結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)，先對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行初步篩選和優(yōu)化，確定其大致的取值范圍，然后再利用響應(yīng)面法進(jìn)行全面的優(yōu)化，這樣可以減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，提高實(shí)驗(yàn)效率。2.3.2發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)酵條件是影響畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的重要因素，對(duì)溫度、pH值、溶氧量等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，能夠?yàn)楫叧嘟湍柑峁┻m宜的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)甜菊醇的高效合成。溫度是影響畢赤酵母生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵因素之一，它對(duì)細(xì)胞內(nèi)的酶活性、代謝途徑以及細(xì)胞膜的流動(dòng)性等都有著重要影響。畢赤酵母的最適生長(zhǎng)溫度一般在28-30℃之間。在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的各種酶能夠保持較高的活性，代謝過程能夠順利進(jìn)行，畢赤酵母的生長(zhǎng)速度較快。當(dāng)溫度高于32℃時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性、酶活性降低，從而影響細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在高溫條件下，一些與甜菊醇合成相關(guān)的酶的活性可能會(huì)受到抑制，使得甜菊醇的合成途徑受阻，產(chǎn)量下降。在低溫條件下，畢赤酵母的生長(zhǎng)速度會(huì)明顯減緩，細(xì)胞的代謝活性也會(huì)降低。這是因?yàn)榈蜏貢?huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸受到阻礙，同時(shí)也會(huì)降低酶的催化效率。在低溫下，畢赤酵母對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用效率降低，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，甜菊醇的合成也會(huì)受到影響。為了確定最適合甜菊醇合成的溫度，需要進(jìn)行一系列的溫度梯度實(shí)驗(yàn)。設(shè)置不同的溫度組，如25℃、28℃、30℃、32℃等，在其他發(fā)酵條件相同的情況下，分別培養(yǎng)畢赤酵母，定期檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況和甜菊醇的合成量。通過比較不同溫度組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定在哪個(gè)溫度下畢赤酵母能夠?qū)崿F(xiàn)最佳的生長(zhǎng)和甜菊醇合成。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)28℃時(shí)甜菊醇的產(chǎn)量最高，此時(shí)畢赤酵母的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，甜菊醇合成相關(guān)的酶活性也較高。pH值對(duì)畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇合成也有著顯著影響。培養(yǎng)基的pH值會(huì)影響細(xì)胞表面的電荷分布，進(jìn)而影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。不同的pH值還會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性和穩(wěn)定性。畢赤酵母生長(zhǎng)的最適pH值一般在5.0-7.0之間。在這個(gè)pH范圍內(nèi)，細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)和代謝，甜菊醇的合成也能較為順利地進(jìn)行。當(dāng)pH值低于5.0時(shí)，酸性環(huán)境可能會(huì)對(duì)畢赤酵母細(xì)胞產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。酸性環(huán)境還可能會(huì)抑制一些與甜菊醇合成相關(guān)的酶的活性，使甜菊醇的合成受到抑制。當(dāng)pH值高于7.0時(shí)，堿性環(huán)境同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性改變，影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出。堿性環(huán)境也可能會(huì)影響甜菊醇合成途徑中某些酶的活性，降低甜菊醇的合成效率。為了優(yōu)化pH值條件，可以通過在培養(yǎng)基中添加緩沖劑來維持pH的穩(wěn)定。常用的緩沖劑有磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液等。在實(shí)驗(yàn)中，可以設(shè)置不同的pH梯度，如pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0等，研究不同pH值對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的影響。通過檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)指標(biāo)和甜菊醇產(chǎn)量，確定最適合畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的pH值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能表明，pH6.0時(shí)畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇合成效果最佳。溶氧量是發(fā)酵過程中的一個(gè)重要參數(shù)，它直接影響著畢赤酵母的呼吸代謝和能量產(chǎn)生。畢赤酵母是好氧微生物，在發(fā)酵過程中需要充足的氧氣來進(jìn)行有氧呼吸，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝提供能量。如果溶氧量不足，畢赤酵母會(huì)進(jìn)行無氧呼吸，產(chǎn)生乙醇、有機(jī)酸等代謝副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物不僅會(huì)消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可能對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和甜菊醇的合成產(chǎn)生抑制作用。溶氧量過高也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，過高的溶氧量會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等，這些活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等造成氧化損傷，影響細(xì)胞的正常生理功能。為了優(yōu)化溶氧量條件，可以通過調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量等方式來控制發(fā)酵體系中的溶氧量。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵中，可以通過改變搖床的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)溶氧量。在搖瓶培養(yǎng)時(shí)，設(shè)置不同的轉(zhuǎn)速，如150r/min、200r/min、250r/min、300r/min等，研究不同轉(zhuǎn)速下?lián)u瓶?jī)?nèi)的溶氧量對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的影響。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，可以通過調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度來精確控制溶氧量。通過安裝溶氧電極，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中的溶氧量，并根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果自動(dòng)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度，使溶氧量保持在適宜的范圍內(nèi)。通過實(shí)驗(yàn)確定最佳的溶氧量條件，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)當(dāng)攪拌速度為250r/min，通氣量為1.5vvm（體積/體積/分鐘）時(shí)，畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇合成效果最佳。三、畢赤酵母中甜菊醇異源合成技術(shù)的優(yōu)化3.1基因表達(dá)調(diào)控的優(yōu)化3.1.1啟動(dòng)子的優(yōu)化與選擇啟動(dòng)子作為基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵順式元件，對(duì)甜菊醇合成基因在畢赤酵母中的表達(dá)起著至關(guān)重要的作用。不同類型的啟動(dòng)子具有各自獨(dú)特的特性，這些特性直接影響著基因表達(dá)的水平、時(shí)機(jī)以及穩(wěn)定性，進(jìn)而對(duì)甜菊醇的合成效率產(chǎn)生顯著影響。甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PAOX1是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中最為常用且研究較為深入的啟動(dòng)子之一。PAOX1屬于強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在甲醇作為唯一碳源時(shí)，能夠被強(qiáng)烈激活，從而高效驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)。當(dāng)畢赤酵母在含有甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，甲醇會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一系列調(diào)控因子的表達(dá)和激活，這些調(diào)控因子與PAOX1啟動(dòng)子上的特定順式作用元件相互作用，使得PAOX1啟動(dòng)子處于高度活躍狀態(tài)，促進(jìn)甜菊醇合成基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而提高甜菊醇的合成量。在一些研究中，利用PAOX1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)甜菊醇合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，在甲醇誘導(dǎo)下，甜菊醇的產(chǎn)量得到了顯著提高。PAOX1啟動(dòng)子也存在一些局限性。甲醇具有易燃、易揮發(fā)的特性，在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過程中，甲醇的儲(chǔ)存和使用需要嚴(yán)格的安全措施，這增加了生產(chǎn)的復(fù)雜性和成本。甲醇的使用還可能對(duì)環(huán)境造成一定的影響，不符合綠色生產(chǎn)的理念。如果甲醇誘導(dǎo)的時(shí)機(jī)和劑量控制不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，甚至對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響甜菊醇的合成效率。組成型啟動(dòng)子PGAP則具有不同的特性。PGAP是一種組成型表達(dá)的啟動(dòng)子，它能夠在多種碳源（如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸等）存在的條件下持續(xù)驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，而不需要額外添加誘導(dǎo)物。這一特性使得在使用PGAP啟動(dòng)子進(jìn)行甜菊醇合成時(shí)，發(fā)酵過程更加簡(jiǎn)單，無需進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)等復(fù)雜操作，降低了生產(chǎn)過程的控制難度。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，PGAP啟動(dòng)子能夠穩(wěn)定地驅(qū)動(dòng)甜菊醇合成基因的表達(dá)，畢赤酵母細(xì)胞能夠持續(xù)合成甜菊醇。由于PGAP啟動(dòng)子的表達(dá)不受嚴(yán)格調(diào)控，在細(xì)胞生長(zhǎng)的各個(gè)階段都持續(xù)表達(dá)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)過重，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和其他生理功能。在某些情況下，持續(xù)的基因表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致甜菊醇合成相關(guān)的酶過度表達(dá)，這些酶可能會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡產(chǎn)生影響，甚至對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。PGAP啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)PAOX1啟動(dòng)子在誘導(dǎo)狀態(tài)下可能較低，這可能會(huì)限制甜菊醇的合成量。為了選擇和優(yōu)化適合甜菊醇合成的啟動(dòng)子，研究人員通常會(huì)進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)和分析。會(huì)構(gòu)建不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)甜菊醇合成基因的重組表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中。通過比較不同啟動(dòng)子在相同培養(yǎng)條件下對(duì)甜菊醇合成基因表達(dá)水平的影響，包括mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)，來評(píng)估啟動(dòng)子的效率。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以檢測(cè)甜菊醇合成基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，通過比較不同啟動(dòng)子組的mRNA相對(duì)表達(dá)量，判斷啟動(dòng)子對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-Blot）等技術(shù)可以檢測(cè)甜菊醇合成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步確定啟動(dòng)子對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。還會(huì)考察不同啟動(dòng)子在不同碳源條件下的表達(dá)特性。在含有葡萄糖、甘油、甲醇等不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶不同啟動(dòng)子的畢赤酵母菌株，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和甜菊醇的合成量。通過分析不同碳源對(duì)啟動(dòng)子活性的影響，確定最適合甜菊醇合成的碳源和啟動(dòng)子組合。研究人員還會(huì)考慮啟動(dòng)子與其他調(diào)控元件之間的相互作用。啟動(dòng)子的活性可能會(huì)受到上游激活序列（UAS）、增強(qiáng)子等調(diào)控元件的影響，通過研究這些調(diào)控元件與啟動(dòng)子的協(xié)同作用，可以進(jìn)一步優(yōu)化啟動(dòng)子的性能，提高甜菊醇合成基因的表達(dá)效率。3.1.2轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子作為一類能夠與DNA序列特異性結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，在畢赤酵母中甜菊醇合成基因的表達(dá)調(diào)控過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們通過與啟動(dòng)子區(qū)域以及其他順式作用元件相互作用，精確地調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的起始、速率和終止，從而影響甜菊醇合成相關(guān)酶的表達(dá)水平，最終對(duì)甜菊醇的合成效率產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在畢赤酵母中，存在多種轉(zhuǎn)錄因子參與了甜菊醇合成基因的表達(dá)調(diào)控。某些轉(zhuǎn)錄因子能夠與甜菊醇合成基因的啟動(dòng)子區(qū)域緊密結(jié)合，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。這些轉(zhuǎn)錄因子可以識(shí)別啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列，如TATA盒、CAAT盒等，通過與這些序列的特異性結(jié)合，引導(dǎo)RNA聚合酶準(zhǔn)確地結(jié)合到啟動(dòng)子上，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過程。一些激活型轉(zhuǎn)錄因子能夠與啟動(dòng)子上的增強(qiáng)子元件結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的穩(wěn)定性，提高基因轉(zhuǎn)錄的效率，進(jìn)而增加甜菊醇合成相關(guān)酶的表達(dá)量，促進(jìn)甜菊醇的合成。除了促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子外，還存在一些抑制型轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠與啟動(dòng)子區(qū)域或其他調(diào)控元件結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，或者抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而抑制甜菊醇合成基因的表達(dá)。這些抑制型轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)可能受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞處于某些特定的生理狀態(tài)或受到外界環(huán)境刺激時(shí)，抑制型轉(zhuǎn)錄因子的活性可能會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響甜菊醇合成基因的表達(dá)。在細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏或受到脅迫時(shí)，某些抑制型轉(zhuǎn)錄因子可能會(huì)被激活，抑制甜菊醇合成基因的表達(dá)，以維持細(xì)胞的正常生理功能。為了提高甜菊醇合成基因的表達(dá)水平，研究人員采用了多種策略來調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。通過基因工程手段過表達(dá)關(guān)鍵的激活型轉(zhuǎn)錄因子是一種常用的策略。從畢赤酵母基因組中克隆出編碼激活型轉(zhuǎn)錄因子的基因，將其連接到合適的表達(dá)載體上，并導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞中，使其在細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)。過表達(dá)的激活型轉(zhuǎn)錄因子可以與更多的甜菊醇合成基因啟動(dòng)子結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，從而提高甜菊醇合成相關(guān)酶的表達(dá)量，促進(jìn)甜菊醇的合成。在某些研究中，過表達(dá)特定的激活型轉(zhuǎn)錄因子后，甜菊醇合成基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，甜菊醇的產(chǎn)量也相應(yīng)增加。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以增強(qiáng)其與DNA的結(jié)合能力或轉(zhuǎn)錄激活能力，也是一種有效的策略。通過定點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)域融合等技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造，改變其氨基酸序列，從而優(yōu)化其功能。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造，使其能夠更緊密地結(jié)合到甜菊醇合成基因的啟動(dòng)子上，提高轉(zhuǎn)錄效率。還可以將轉(zhuǎn)錄因子與其他具有轉(zhuǎn)錄激活功能的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄激活能力，促進(jìn)甜菊醇合成基因的表達(dá)。研究人員還嘗試篩選和鑒定能夠調(diào)控甜菊醇合成基因表達(dá)的新型轉(zhuǎn)錄因子。通過對(duì)畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子文庫進(jìn)行篩選，利用酵母單雜交等技術(shù)，尋找能夠與甜菊醇合成基因啟動(dòng)子特異性結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。一旦發(fā)現(xiàn)新型轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制和功能，為甜菊醇的異源合成提供新的調(diào)控靶點(diǎn)。在篩選過程中，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一些具有獨(dú)特調(diào)控功能的轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠在不同的條件下對(duì)甜菊醇合成基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，為優(yōu)化甜菊醇合成工藝提供更多的選擇。3.2代謝途徑的優(yōu)化3.2.1前體物質(zhì)供應(yīng)的優(yōu)化前體物質(zhì)的充足供應(yīng)是甜菊醇高效合成的關(guān)鍵前提，其對(duì)甜菊醇合成的影響貫穿于整個(gè)代謝過程。在畢赤酵母中，甜菊醇的生物合成起始于甲羥戊酸（MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑，這兩條途徑共同生成異戊烯基焦磷酸（IPP）及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），它們是萜類化合物合成的通用前體，也是甜菊醇合成的重要起始物質(zhì)。IPP和DMAPP在一系列酶的作用下，逐步縮合形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP），GGPP作為甜菊醇生物合成的直接前體，其含量的高低直接影響著甜菊醇的合成效率。如果前體物質(zhì)IPP和DMAPP供應(yīng)不足，GGPP的合成量也會(huì)相應(yīng)減少，進(jìn)而導(dǎo)致甜菊醇的合成受到限制。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)IPP和DMAPP的濃度較低時(shí)，甜菊醇的產(chǎn)量明顯下降。為了提高前體物質(zhì)的供應(yīng)，研究人員采用了多種策略來優(yōu)化代謝途徑。強(qiáng)化MVA途徑和MEP途徑是常用的方法之一。通過基因工程手段過表達(dá)MVA途徑和MEP途徑中的關(guān)鍵酶基因，能夠增強(qiáng)這兩條途徑的代謝通量，促進(jìn)IPP和DMAPP的合成。在MVA途徑中，過表達(dá)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因，該酶是MVA途徑的限速酶，它能夠催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原為甲羥戊酸（MVA），是MVA途徑中的關(guān)鍵步驟。過表達(dá)HMGR基因可以顯著提高HMGR的表達(dá)水平和酶活性，使MVA的合成量增加，進(jìn)而促進(jìn)IPP和DMAPP的合成。在MEP途徑中，過表達(dá)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）基因，DXS是MEP途徑的關(guān)鍵酶，它催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP），是MEP途徑的起始步驟。過表達(dá)DXS基因能夠增強(qiáng)MEP途徑的代謝通量，提高DXP的合成量，從而促進(jìn)IPP和DMAPP的合成。在某些研究中，同時(shí)過表達(dá)MVA途徑和MEP途徑中的關(guān)鍵酶基因，使得IPP和DMAPP的合成量大幅增加，甜菊醇的產(chǎn)量也得到了顯著提高。還可以通過調(diào)節(jié)代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，減少前體物質(zhì)的消耗，提高其在甜菊醇合成途徑中的利用率。在畢赤酵母中，IPP和DMAPP除了用于甜菊醇的合成外，還參與其他萜類化合物的合成，如角鯊烯、麥角固醇等。通過基因敲除或下調(diào)參與其他萜類化合物合成途徑的關(guān)鍵酶基因，如角鯊烯合酶（SQS）基因，能夠減少IPP和DMAPP向其他萜類化合物合成途徑的分流，使更多的前體物質(zhì)用于甜菊醇的合成。在研究中發(fā)現(xiàn)，敲除SQS基因后，畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)的角鯊烯合成量顯著減少，而甜菊醇的前體物質(zhì)IPP和DMAPP的含量增加，甜菊醇的產(chǎn)量也相應(yīng)提高。還可以通過調(diào)節(jié)代謝途徑中的反饋抑制機(jī)制，解除前體物質(zhì)合成過程中的反饋抑制，促進(jìn)前體物質(zhì)的合成。在MVA途徑中，甲羥戊酸激酶（MVK）的活性受到甲羥戊酸-5-磷酸（MVAP）的反饋抑制。通過對(duì)MVK進(jìn)行改造，使其對(duì)MVAP的反饋抑制不敏感，能夠解除反饋抑制，促進(jìn)MVA的合成，進(jìn)而提高IPP和DMAPP的合成量。3.2.2關(guān)鍵酶的改造與優(yōu)化對(duì)甜菊醇合成關(guān)鍵酶進(jìn)行改造和優(yōu)化是提高甜菊醇合成效率的重要策略，這些關(guān)鍵酶的活性和穩(wěn)定性直接決定了甜菊醇合成途徑的效率和產(chǎn)量。定點(diǎn)突變是一種常用的改造關(guān)鍵酶的方法，它通過對(duì)關(guān)鍵酶基因的特定堿基進(jìn)行突變，改變酶的氨基酸序列，從而優(yōu)化酶的活性、穩(wěn)定性和底物特異性。在貝殼杉烯合成酶（KS）中，研究人員通過對(duì)其活性中心附近的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，改變了酶與底物的結(jié)合能力和催化活性。在某些研究中，將KS活性中心的一個(gè)氨基酸殘基由丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變后的KS對(duì)底物古巴焦磷酸（CPP）的親和力顯著提高，催化效率也得到了增強(qiáng)，從而促進(jìn)了貝殼杉烯的合成，為后續(xù)甜菊醇的合成提供了更多的前體物質(zhì)。定向進(jìn)化是另一種強(qiáng)大的酶改造技術(shù)，它通過模擬自然進(jìn)化過程，在體外對(duì)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變和篩選，從而獲得具有更優(yōu)良性能的酶變體。在定向進(jìn)化過程中，首先利用易錯(cuò)PCR等技術(shù)對(duì)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建突變文庫。易錯(cuò)PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入一定濃度的錳離子或改變鎂離子濃度等條件，使DNA聚合酶在擴(kuò)增過程中發(fā)生堿基錯(cuò)配，從而引入隨機(jī)突變。通過這種方法可以獲得大量的突變基因，構(gòu)建出包含各種酶變體的突變文庫。然后，利用高通量篩選技術(shù)從突變文庫中篩選出具有目標(biāo)性能的酶變體。高通量篩選技術(shù)可以快速、高效地對(duì)大量酶變體進(jìn)行活性檢測(cè)和篩選，例如利用96孔板或384孔板等高通量實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，結(jié)合熒光標(biāo)記、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等檢測(cè)方法，對(duì)突變文庫中的酶變體進(jìn)行篩選。在篩選過程中，以甜菊醇產(chǎn)量或關(guān)鍵酶活性為篩選指標(biāo)，挑選出表現(xiàn)優(yōu)異的酶變體。對(duì)篩選得到的酶變體進(jìn)行進(jìn)一步的表征和優(yōu)化，確定其最佳的反應(yīng)條件和應(yīng)用效果。通過定向進(jìn)化技術(shù)，研究人員成功獲得了一些活性和穩(wěn)定性顯著提高的甜菊醇合成關(guān)鍵酶變體。在對(duì)貝殼杉烯氧化酶（KO）的定向進(jìn)化研究中，經(jīng)過多輪易錯(cuò)PCR和高通量篩選，獲得了一種KO變體，其催化活性比野生型KO提高了數(shù)倍，在甜菊醇的合成中表現(xiàn)出更好的性能，顯著提高了甜菊醇的產(chǎn)量。除了定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化技術(shù)外，還可以通過蛋白質(zhì)工程的其他方法對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行改造和優(yōu)化。通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)解析關(guān)鍵酶的三維結(jié)構(gòu)，了解酶的活性中心、底物結(jié)合位點(diǎn)以及與其他分子的相互作用方式，為酶的改造提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。利用分子動(dòng)力學(xué)模擬等計(jì)算生物學(xué)方法，預(yù)測(cè)酶突變后的結(jié)構(gòu)和功能變化，指導(dǎo)定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。還可以通過融合蛋白技術(shù)，將關(guān)鍵酶與其他具有特定功能的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合，賦予關(guān)鍵酶新的性能。將具有增強(qiáng)穩(wěn)定性的蛋白結(jié)構(gòu)域與甜菊醇合成關(guān)鍵酶融合，提高酶的穩(wěn)定性，使其在發(fā)酵過程中能夠保持較高的活性，從而促進(jìn)甜菊醇的合成。3.3發(fā)酵過程的優(yōu)化3.3.1補(bǔ)料策略的優(yōu)化補(bǔ)料策略是發(fā)酵過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它對(duì)畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇的合成具有顯著影響。不同的補(bǔ)料策略，如分批補(bǔ)料和連續(xù)補(bǔ)料，各自具有獨(dú)特的特點(diǎn)和適用場(chǎng)景，能夠通過調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，影響畢赤酵母的代謝活動(dòng)和甜菊醇的合成效率。分批補(bǔ)料策略是在發(fā)酵過程中，按照一定的時(shí)間間隔或菌體生長(zhǎng)狀態(tài)，分批次向發(fā)酵體系中添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在畢赤酵母發(fā)酵合成甜菊醇的過程中，通常會(huì)在菌體生長(zhǎng)階段和誘導(dǎo)階段采用不同的分批補(bǔ)料方式。在菌體生長(zhǎng)階段，以甘油作為碳源進(jìn)行分批補(bǔ)料，能夠?yàn)楫叧嘟湍傅纳L(zhǎng)提供穩(wěn)定的能量供應(yīng)，促進(jìn)菌體的快速增殖。當(dāng)菌體生長(zhǎng)到一定密度后，切換至以甲醇作為碳源進(jìn)行誘導(dǎo)階段的分批補(bǔ)料，甲醇能夠誘導(dǎo)畢赤酵母中醇氧化酶基因（AOX1）的表達(dá)，從而啟動(dòng)甜菊醇合成相關(guān)基因的表達(dá)。在一些研究中，采用分批補(bǔ)料策略，在菌體生長(zhǎng)階段每隔一定時(shí)間添加適量的甘油，使菌體生物量迅速增加；在誘導(dǎo)階段，按照一定的時(shí)間間隔添加甲醇，有效提高了甜菊醇的合成量。分批補(bǔ)料策略的優(yōu)點(diǎn)在于能夠根據(jù)菌體的生長(zhǎng)需求和代謝狀態(tài)，靈活調(diào)整營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加量和添加時(shí)間，避免了一次性添加過多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致的代謝抑制或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)。通過合理的分批補(bǔ)料，可以維持發(fā)酵體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的適宜濃度，促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和甜菊醇的合成。分批補(bǔ)料策略也存在一些不足之處，如補(bǔ)料操作相對(duì)繁瑣，需要精確控制補(bǔ)料的時(shí)間和量，否則可能會(huì)影響發(fā)酵效果。頻繁的補(bǔ)料操作還可能增加染菌的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)發(fā)酵設(shè)備和操作環(huán)境的要求較高。連續(xù)補(bǔ)料策略則是在發(fā)酵過程中，以恒定的速率或根據(jù)菌體生長(zhǎng)的實(shí)時(shí)情況，連續(xù)不斷地向發(fā)酵體系中添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)甜菊醇時(shí)，連續(xù)補(bǔ)料策略可以通過在線監(jiān)測(cè)菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)和發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度，利用蠕動(dòng)泵等設(shè)備，將碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以恒定的流速加入到發(fā)酵體系中。在一些研究中，采用連續(xù)補(bǔ)料策略，以一定的流速連續(xù)添加甲醇，使發(fā)酵體系中甲醇的濃度保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，實(shí)現(xiàn)了甜菊醇的持續(xù)合成。連續(xù)補(bǔ)料策略的優(yōu)勢(shì)在于能夠維持發(fā)酵體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度的相對(duì)穩(wěn)定，避免了分批補(bǔ)料過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度的波動(dòng)，有利于菌體的穩(wěn)定生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)的持續(xù)進(jìn)行。這種策略還可以減少補(bǔ)料操作的次數(shù)，降低染菌的風(fēng)險(xiǎn)，提高發(fā)酵過程的自動(dòng)化程度。連續(xù)補(bǔ)料策略也存在一些局限性，如對(duì)發(fā)酵設(shè)備和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的要求較高，需要精確控制補(bǔ)料的流速和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度。如果補(bǔ)料流速控制不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累或不足，影響菌體的生長(zhǎng)和甜菊醇的合成。為了優(yōu)化補(bǔ)料策略，提高甜菊醇的產(chǎn)量和發(fā)酵效率，研究人員通常會(huì)綜合考慮多種因素。會(huì)根據(jù)畢赤酵母的生長(zhǎng)特性和甜菊醇的合成途徑，確定最佳的補(bǔ)料時(shí)間和補(bǔ)料量。在菌體生長(zhǎng)階段，根據(jù)菌體的生長(zhǎng)曲線和代謝需求，確定甘油的補(bǔ)料速率和補(bǔ)料時(shí)間，以促進(jìn)菌體的快速生長(zhǎng)和生物量的積累。在誘導(dǎo)階段，根據(jù)甲醇對(duì)AOX1啟動(dòng)子的誘導(dǎo)特性和甜菊醇合成的動(dòng)力學(xué)曲線，確定甲醇的補(bǔ)料速率和補(bǔ)料時(shí)間，以提高甜菊醇的合成效率。還會(huì)考慮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的比例和協(xié)同作用。碳源和氮源的比例對(duì)畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇的合成有著重要影響，合理調(diào)整碳氮比，能夠優(yōu)化菌體的代謝途徑，提高甜菊醇的產(chǎn)量。在補(bǔ)料過程中，還可以添加一些微量元素和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為菌體的生長(zhǎng)和代謝提供全面的營(yíng)養(yǎng)支持。研究人員還會(huì)結(jié)合在線監(jiān)測(cè)技術(shù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵體系中的菌體密度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、pH值、溶氧量等參數(shù)，根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果及時(shí)調(diào)整補(bǔ)料策略，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的精準(zhǔn)控制。利用溶氧電極實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中的溶氧量，當(dāng)溶氧量低于設(shè)定值時(shí)，適當(dāng)增加通氣量或調(diào)整補(bǔ)料速率，以保證菌體的有氧呼吸和正常代謝。3.3.2發(fā)酵過程控制參數(shù)的優(yōu)化發(fā)酵過程控制參數(shù)，如溫度、pH值和溶氧量等，對(duì)畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇的合成起著至關(guān)重要的作用。通過優(yōu)化這些參數(shù)，可以為畢赤酵母提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)甜菊醇的高效合成。溫度是影響畢赤酵母生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵因素之一，它對(duì)細(xì)胞內(nèi)的酶活性、代謝途徑以及細(xì)胞膜的流動(dòng)性等都有著重要影響。畢赤酵母的最適生長(zhǎng)溫度一般在28-30℃之間。在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的各種酶能夠保持較高的活性，代謝過程能夠順利進(jìn)行，畢赤酵母的生長(zhǎng)速度較快。當(dāng)溫度高于32℃時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性、酶活性降低，從而影響細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在高溫條件下，一些與甜菊醇合成相關(guān)的酶的活性可能會(huì)受到抑制，使得甜菊醇的合成途徑受阻，產(chǎn)量下降。在低溫條件下，畢赤酵母的生長(zhǎng)速度會(huì)明顯減緩，細(xì)胞的代謝活性也會(huì)降低。這是因?yàn)榈蜏貢?huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸受到阻礙，同時(shí)也會(huì)降低酶的催化效率。在低溫下，畢赤酵母對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用效率降低，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，甜菊醇的合成也會(huì)受到影響。為了確定最適合甜菊醇合成的溫度，需要進(jìn)行一系列的溫度梯度實(shí)驗(yàn)。設(shè)置不同的溫度組，如25℃、28℃、30℃、32℃等，在其他發(fā)酵條件相同的情況下，分別培養(yǎng)畢赤酵母，定期檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況和甜菊醇的合成量。通過比較不同溫度組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定在哪個(gè)溫度下畢赤酵母能夠?qū)崿F(xiàn)最佳的生長(zhǎng)和甜菊醇合成。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)28℃時(shí)甜菊醇的產(chǎn)量最高，此時(shí)畢赤酵母的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，甜菊醇合成相關(guān)的酶活性也較高。pH值對(duì)畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇合成也有著顯著影響。培養(yǎng)基的pH值會(huì)影響細(xì)胞表面的電荷分布，進(jìn)而影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。不同的pH值還會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性和穩(wěn)定性。畢赤酵母生長(zhǎng)的最適pH值一般在5.0-7.0之間。在這個(gè)pH范圍內(nèi)，細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)和代謝，甜菊醇的合成也能較為順利地進(jìn)行。當(dāng)pH值低于5.0時(shí)，酸性環(huán)境可能會(huì)對(duì)畢赤酵母細(xì)胞產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。酸性環(huán)境還可能會(huì)抑制一些與甜菊醇合成相關(guān)的酶的活性，使甜菊醇的合成受到抑制。當(dāng)pH值高于7.0時(shí)，堿性環(huán)境同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性改變，影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出。堿性環(huán)境也可能會(huì)影響甜菊醇合成途徑中某些酶的活性，降低甜菊醇的合成效率。為了優(yōu)化pH值條件，可以通過在培養(yǎng)基中添加緩沖劑來維持pH的穩(wěn)定。常用的緩沖劑有磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液等。在實(shí)驗(yàn)中，可以設(shè)置不同的pH梯度，如pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0等，研究不同pH值對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的影響。通過檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)指標(biāo)和甜菊醇產(chǎn)量，確定最適合畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的pH值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能表明，pH6.0時(shí)畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇合成效果最佳。溶氧量是發(fā)酵過程中的一個(gè)重要參數(shù)，它直接影響著畢赤酵母的呼吸代謝和能量產(chǎn)生。畢赤酵母是好氧微生物，在發(fā)酵過程中需要充足的氧氣來進(jìn)行有氧呼吸，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝提供能量。如果溶氧量不足，畢赤酵母會(huì)進(jìn)行無氧呼吸，產(chǎn)生乙醇、有機(jī)酸等代謝副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物不僅會(huì)消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可能對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和甜菊醇的合成產(chǎn)生抑制作用。溶氧量過高也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，過高的溶氧量會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等，這些活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等造成氧化損傷，影響細(xì)胞的正常生理功能。為了優(yōu)化溶氧量條件，可以通過調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量等方式來控制發(fā)酵體系中的溶氧量。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵中，可以通過改變搖床的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)溶氧量。在搖瓶培養(yǎng)時(shí)，設(shè)置不同的轉(zhuǎn)速，如150r/min、200r/min、250r/min、300r/min等，研究不同轉(zhuǎn)速下?lián)u瓶?jī)?nèi)的溶氧量對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和甜菊醇合成的影響。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，可以通過調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度來精確控制溶氧量。通過安裝溶氧電極，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中的溶氧量，并根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果自動(dòng)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度，使溶氧量保持在適宜的范圍內(nèi)。通過實(shí)驗(yàn)確定最佳的溶氧量條件，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)當(dāng)攪拌速度為250r/min，通氣量為1.5vvm（體積/體積/分鐘）時(shí)，畢赤酵母的生長(zhǎng)和甜菊醇合成效果最佳。四、案例分析4.1成功案例分析4.1.1案例介紹某研究團(tuán)隊(duì)致力于利用畢赤酵母實(shí)現(xiàn)甜菊醇的異源合成，他們精心設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了一套系統(tǒng)的技術(shù)路線，旨在突破甜菊醇傳統(tǒng)生產(chǎn)方式的局限，為其高效生產(chǎn)開辟新途徑。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，研究團(tuán)隊(duì)首先從甜葉菊中克隆出甜菊醇合成的關(guān)鍵基因，包括古巴焦磷酸合酶（CPPS）基因、貝殼杉烯合成酶（KS）基因和貝殼杉烯氧化酶（KO）基因。他們采用改良的CTAB法從新鮮的甜葉菊葉片中提取高質(zhì)量的總RNA，通過紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA的濃度和質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格檢測(cè)，確保其符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。利用逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得目標(biāo)基因。在PCR擴(kuò)增過程中，研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)目標(biāo)基因的保守序列設(shè)計(jì)了特異性引物，并在引物兩端引入了合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便后續(xù)與表達(dá)載體進(jìn)行連接。擴(kuò)增得到的目標(biāo)基因通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，確保其大小和純度符合預(yù)期。表達(dá)載體的構(gòu)建是該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一。研究團(tuán)隊(duì)選用了畢赤酵母常用的表達(dá)載體pPIC9K，該載體含有醇氧化酶基因AOX1啟動(dòng)子，能夠在甲醇的誘導(dǎo)下高效啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。他們將擴(kuò)增得到的CPPS、KS和KO基因分別與pPIC9K載體進(jìn)行連接，構(gòu)建出重組表達(dá)載體。在連接過程中，采用限制性內(nèi)切酶雙酶切法，將目標(biāo)基因和pPIC9K載體分別用相同的兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，然后通過T4DNA連接酶將酶切后的目標(biāo)基因片段和線性化的pPIC9K載體連接起來。連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增和篩選，挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證，確保重組表達(dá)載體中目標(biāo)基因的序列正確且連接無誤。將重組表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母是實(shí)現(xiàn)甜菊醇異源合成的重要環(huán)節(jié)。研究團(tuán)隊(duì)采用電轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母GS115菌株中。在電轉(zhuǎn)化前，他們精心制備了畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。首先挑取畢赤酵母GS115單菌落接種至含有5mlYPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，在30℃、250r/min的條件下培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取100μl培養(yǎng)物接種至含有50ml新鮮YPD培養(yǎng)基的200mL三角搖瓶中，繼續(xù)在30℃、250r/min的條件下培養(yǎng)過夜，直至細(xì)胞密度OD600達(dá)到1.3-1.5。將培養(yǎng)好的細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃、1500g離心5min，收集菌體沉淀，用50ml冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸，再次離心后，用25ml冰預(yù)冷的無菌水重懸菌體，重復(fù)此步驟，以充分洗滌細(xì)胞，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。最后用2ml1M冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，再次離心后，用160μl冰預(yù)冷的1mol山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，得到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體用SalI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理，然后與畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞充分混勻，轉(zhuǎn)移至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中。將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min，使細(xì)胞與DNA充分結(jié)合，然后按照優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化參數(shù)（電壓1.5kV，電容25μF，電阻200Ω）進(jìn)行電擊，電擊時(shí)間為4msec。電擊完畢后，馬上加入1ml1M冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中。將菌體懸液涂布于MD平板上，每200μl涂布一塊平板，將平板置于30℃倒置培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。篩選陽性轉(zhuǎn)化子是確保獲得能夠合成甜菊醇的畢赤酵母菌株的關(guān)鍵步驟。研究團(tuán)隊(duì)采用基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)的篩選策略，利用畢赤酵母GS115菌株為組氨酸缺陷型（his4-）的特性，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入該菌株后，若重組載體成功整合到畢赤酵母基因組中，且攜帶的組氨酸合成基因（HIS4）能夠正常表達(dá)，轉(zhuǎn)化后的菌株則能夠在不含組氨酸的MD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化的菌株由于缺乏組氨酸合成能力，無法在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。通過這種方式，初步篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。為了進(jìn)一步驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子中重組表達(dá)載體的整合情況和目的基因的表達(dá)情況，研究團(tuán)隊(duì)利用5’AOX1和3’AOX1引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若重組質(zhì)粒以單交換的方式整合到畢赤酵母基因組中，則會(huì)擴(kuò)增到兩條帶，一條為宿主菌AOX1基因，另一條為包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信號(hào)肽序列的片段。通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，判斷重組表達(dá)載體是否成功整合到畢赤酵母基因組中。4.1.2技術(shù)開發(fā)與優(yōu)化策略分析在技術(shù)開發(fā)與優(yōu)化過程中，該研究團(tuán)隊(duì)采用了一系列策略，從基因表達(dá)調(diào)控、代謝途徑優(yōu)化到發(fā)酵工藝優(yōu)化，全面提升甜菊醇的異源合成效率。在基因表達(dá)調(diào)控方面，團(tuán)隊(duì)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行了深入研究和優(yōu)化。他們比較了甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PAOX1和組成型啟動(dòng)子PGAP在驅(qū)動(dòng)甜菊醇合成基因表達(dá)時(shí)的效果。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PAOX1啟動(dòng)子在甲醇誘導(dǎo)下能夠顯著提高甜菊醇合成基因的表達(dá)水平，從而促進(jìn)甜菊醇的合成。在甲醇存在的條件下，PAOX1啟動(dòng)子被強(qiáng)烈激活，使得甜菊醇合成關(guān)鍵酶的表達(dá)量大幅增加，進(jìn)而提高了甜菊醇的產(chǎn)量。為了克服甲醇使用帶來的安全和成本問題，團(tuán)隊(duì)也對(duì)PGAP啟動(dòng)子進(jìn)行了優(yōu)化。他們通過對(duì)PGAP啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，增強(qiáng)了其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，提高了基因表達(dá)的強(qiáng)度。雖然PGAP啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)PAOX1啟動(dòng)子在誘導(dǎo)狀態(tài)下仍較低，但在某些特定條件下，PGAP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的甜菊醇合成也能達(dá)到一定的水平，為甜菊醇的合成提供了一種可選擇的調(diào)控方式。團(tuán)隊(duì)還利用轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控甜菊醇合成基因的表達(dá)。他們從畢赤酵母基因組中克隆出一些可能參與甜菊醇合成基因表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子基因，并將其導(dǎo)入畢赤酵母中進(jìn)行過表達(dá)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)某些轉(zhuǎn)錄因子能夠顯著提高甜菊醇合成基因的表達(dá)水平，促進(jìn)甜菊醇的合成。在過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子TF1后，甜菊醇合成關(guān)鍵酶的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平都明顯提高，甜菊醇的產(chǎn)量也相應(yīng)增加。這表明轉(zhuǎn)錄因子在甜菊醇合成基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)可以有效提高甜菊醇的合成效率。在代謝途徑優(yōu)化方面，團(tuán)隊(duì)致力于優(yōu)化前體物質(zhì)的供應(yīng)。他們通過基因工程手段過表達(dá)MVA途徑和MEP途徑中的關(guān)鍵酶基因，增強(qiáng)了這兩條途徑的代謝通量，促進(jìn)了異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的合成，為甜菊醇的合成提供了更充足的前體物質(zhì)。過表達(dá)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因，使MVA途徑的限速步驟得到加強(qiáng)，MVA的合成量增加，進(jìn)而促進(jìn)了IPP和DMAPP的合成。過表達(dá)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）基因，增強(qiáng)了MEP途徑的起始步驟，提高了DXP的合成量，也促進(jìn)了IPP和DMAPP的合成。通過同時(shí)優(yōu)化MVA途徑和MEP途徑，甜菊醇的前體物質(zhì)供應(yīng)得到了顯著改善，為甜菊醇的高效合成奠定了基礎(chǔ)。團(tuán)隊(duì)還對(duì)甜菊醇合成關(guān)鍵酶進(jìn)行了改造和優(yōu)化。他們采用定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)貝殼杉烯合成酶（KS）和貝殼杉烯氧化酶（KO）的活性中心進(jìn)行了改造，改變了酶與底物的結(jié)合能力和催化活性。在KS的活性中心，將一個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基由丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，突變后的KS對(duì)底物古巴焦磷酸（CPP）的親和力顯著提高，催化效率也得到了增強(qiáng)，從而促進(jìn)了貝殼杉烯的合成，為后續(xù)甜菊醇的合成提供了更多的前體物質(zhì)。對(duì)KO的活性中心進(jìn)行定點(diǎn)突變后，KO的催化活性和穩(wěn)定性都得到了提高，使得貝殼杉烯能夠更高效地轉(zhuǎn)化為甜菊醇。在發(fā)酵工藝優(yōu)化方面，團(tuán)隊(duì)對(duì)補(bǔ)料策略進(jìn)行了深入研究和優(yōu)化。他們比較了分批補(bǔ)料和連續(xù)補(bǔ)料兩種策略在畢赤酵母發(fā)酵合成甜菊醇過程中的效果。在分批補(bǔ)料策略中，團(tuán)隊(duì)在菌體生長(zhǎng)階段以甘油作為碳源進(jìn)行分批補(bǔ)料，促進(jìn)了菌體的快速增殖；在誘導(dǎo)階段，以甲醇作為碳源進(jìn)行分批補(bǔ)料，有效提高了甜菊醇的合成量。在連續(xù)補(bǔ)料策略中，團(tuán)隊(duì)通過在線監(jiān)測(cè)菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)和發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度，利用蠕動(dòng)泵以恒定的流速連續(xù)添加甲醇，使發(fā)酵體系中甲醇的濃度保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，實(shí)現(xiàn)了甜菊醇的持續(xù)合成。通過比較發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，連續(xù)補(bǔ)料策略能夠更好地維持發(fā)酵體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度的穩(wěn)定，提高甜菊醇的產(chǎn)量和