ICS71.100.70CCSY42團體標準T/ZHCA029—2024化妝品舒緩功效測試角質形成細胞白介素-8生成抑制法Testofsoothingefficacyforcosmetics—Methodforinhibitinginterleukin-8productionofkeratinocytes2024-01-15發布2024-04-15實施浙江省健康產品化妝品行業協會ⅠT/ZHCA029—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由浙江省食品藥品檢驗研究院提出。本文件由浙江省健康產品化妝品行業協會(ZHCA)歸口。本文件起草單位:浙江省食品藥品檢驗研究院、廣東博溪生物科技有限公司、珀萊雅化妝品股份有限公司、愛茉莉太平洋(上海)研發有限公司、高浪控股股份有限公司。1T/ZHCA029—2024化妝品舒緩功效測試角質形成細胞白介素-8生成抑制法1范圍本文件描述了化妝品舒緩功效的一種體外測試方法。本文件適用于可均勻分散在溶液中的化妝品及原料的舒緩功效的測試。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法3術語及定義下列術語和定義適用于本文件。角質形成細胞keratinocyte構成表皮基底層至角質層的主要細胞。3.2白介素-8interleukin-8;IL-8巨噬細胞和上皮細胞等分泌的細胞因子。注1:白介素是白細胞及其他特殊細胞產生并在這些細胞間發揮調節作用的細胞因子。注2:白介素-8是白介素的一種亞型。3.3有助于改善皮膚刺激等狀態的功效。4試驗原理角質形成細胞白介素-8生成抑制法(以下簡稱“本方法”)利用微生物引起角質形成細胞發生刺激反應的原理,即通過脂多糖誘導角質形成細胞表面TLR跨膜受體,激活NF-κB炎癥信號傳導通路,從而下游釋放系列炎癥因子,如IL-8等,引發皮膚出現紅斑、瘙癢等癥狀的過程。通過計算受試物抑制IL-8釋放的水平來反應受試物的舒緩功效。5試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規定的三級水。2T/ZHCA029—20245.1細胞:原代人源角質形成細胞(10代以內)或人永生化表皮角質形成細胞株(如HaCaT)。5.2與角質形成細胞相適應的培養基及血清。5.3胰蛋白酶-EDTA溶液。5.4磷酸鹽緩沖液(PBS):pH7.2~7.4。5.5水,符合GB/T6682規定的三級水。5.6脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),純度≥99%,用水配成25mg/mL儲備液,使用終濃度為60μg/mL的溶液。5.7聚肌胞苷酸(Polyriboinosinicpolyribocytidylicacid,PolyI:C),純度≥90%,用水配成10mg/mL儲備液,使用終濃度為100μg/mL的溶液。5.8噻唑藍(MTT),純度≥98%,臨用新配成0.5mg/mL的MTT溶液。5.9二甲基亞砜(DMSO)。5.10人IL-8ELISA檢測試劑盒(采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法)或其他IL-8檢測試劑。5.11陽性對照物:地塞米松,純度≥98%,用二甲基亞砜配成100mg/mL儲備液,使用終濃度為100μg/mL的溶液。5.12陰性對照組:分別加入聚肌胞苷酸和脂多糖于培養基中,聚肌胞苷酸的終濃度為60μg/mL,脂多糖的終濃度為100μg/mL,作為陰性對照溶液。5.13陽性對照組:聚肌胞苷酸和脂多糖誘導液處理4h后再加入終濃度為100μg/mL地塞米松溶液。5.14空白對照組:不加聚肌胞苷酸和脂多糖誘導的培養基,其余操作與陰性對照組一致。6儀器6.1天平:分度值為0.0001g。6.2二氧化碳培養箱:37℃±1℃,CO2體積分數范圍內(5±1)%,相對濕度≥95%。6.3可調節移液器:最大量程為1000μL、200μL、20μL。6.4超凈工作臺。6.5水平低速離心機:轉速大于或等于1000r/min。6.6倒置顯微鏡:放大倍數至少為400或以上。6.7細胞培養板振蕩器。6.8酶標儀。7試驗步驟7.1實驗前準備7.1.1受試物準備受試物制備需要滿足以下條件:a)水溶性受試物直接采用培養基作為溶劑,水難溶的受試物采用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑;b)使用渦旋混合、超聲處理或加熱等方法輔助溶解,配成溶液或均勻混懸液;c)無法配成溶液或均勻混懸液的受試物不適用于本試驗;d)受試物應臨用新配。3T/ZHCA029—20247.1.2刺激物準備分別加入聚肌胞苷酸和脂多糖于細胞培養基中,聚肌胞苷酸的終濃度為60μg/mL,脂多糖的終濃度為100μg/mL,誘導劑量可根據不同實驗室細胞特性適當進行調整。7.2預試驗(細胞毒性試驗)7.2.1細胞接種選用生長良好的角質形成細胞,以1×105個/mL~2×105個/mL的細胞懸液接種,每孔100μL接種到96孔板中。培養箱中培養24h±2h,細胞融合度應在60%~80%時進行試驗。7.2.2分組加樣受試物以原液作為最高劑量,2倍稀釋多個濃度至幾乎無毒性,用于預試驗細胞毒性篩選。預試驗設受試物組和陰性對照組,每組至少3個復孔。先吸去96孔板中的培養液,分別加入受試物組溶液和陰性對照組溶液。每孔加樣量均為100μL,再放入二氧化碳培養箱中培養24h。7.2.3細胞存活率測定和計算以MTT法為例,細胞培養24h后,每孔加入100μL0.5mg/mL的MTT溶液,于培養箱中培養4h±15min。孵育結束后,吸取MTT溶液,每孔加入150μLDMSO,將96孔板放置于振蕩器上,避光振搖10min。酶標儀490nm處讀取吸光度值(OD值)。7.2.4計算細胞存活率計算各組平均吸光度值,并用平均吸光度值來計算各受試物組細胞存活率,見公式(1)。細胞存活率=EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up6(受試物組平均吸光度值),陰性對照組平均吸光度值)×100%……(1)7.3正式試驗7.3.1試驗濃度選擇選擇細胞存活率達到90%左右的濃度作為起始濃度,下設1個~3個濃度,作為正式試驗的濃度。具體濃度選擇可根據試驗情況做出適當調整。7.3.2細胞接種選用生長良好的角質形成細胞,以1×105個/mL~2×105個/mL的細胞懸液接種,每孔1mL到24孔板中,培養24h±2h。7.3.3加樣正式試驗設受試物組、陰性對照組、陽性對照組和空白對照組,每組至少3個復孔。棄去培養板中的培養液,受試物組和陰性對照組分別加入受試物組溶液和陰性對照組溶液;陽性對照組先加誘導液處理4h后再加入陽性對照液;空白對照組加入細胞培養液。每孔加樣量為1mL。加樣后放回培養箱中培養24h±2h。4T/ZHCA029—20247.3.4細胞上清收集培養結束后,分別收集每孔細胞的上清液于1.5mL離心管中,放入-80℃超低溫冰箱冷凍保存。7.3.5IL-8檢測和計算對每組上清液進行IL-8含量測定。具體根據IL-8ELISA檢測試劑盒或其他檢測試劑盒操作說明進行。以IL-8ELISA檢測為例,以標準品的濃度為縱坐標,450nm處吸光度值為橫坐標,繪制標準曲線,得出回歸方程式。將每孔測定的450nm吸光度值代入標準曲線中,計算每孔上清液IL-8含量。7.4IL-8抑制率計算:計算每組IL-8含量均值,用每組IL-8含量均值進行抑制率計算,見公式(2)。抑制率=?1-),÷×100%…………(2)式中:T—受試物組或陽性對照組IL-8含量均值;C—陰性對照組IL-8含量均值。7.5統計分析比較各受試物組、陽性對照組與空白對照組IL-8含量,采用方差檢驗進行統計學分析,p<0.05表明統計學上有顯著性差異。8結果判定8.1試驗成立的條件8.1.1試驗系統有效每次試驗均須設置陰性對照組、陽性對照組以及空白對照組。陰性對照組相較空白對照組IL-8的含量顯著性增加(具有統計學差異p<0.05),則試驗模型有效。陽性對照組相較陰性對照組IL-8含量顯著性降低(具有統計學差異p<0.05),則試驗系統有效。8.1.2試驗平行性有效每次試驗各組平行孔間吸光度的變異系數CV值≤30%,則數據有效。每次試驗至少要重復1次,結果一致,則該試驗有效。8.2結果判定受試物組與陰性對照組相比,IL-8的含量下降,且具有顯著性差異(p<0.05),說明受試物在該劑量下有抑制IL-8含量的作用。受試物任何一個劑量條件下呈現顯著的抑制作用并有可重復性,則該受試物判定為有舒緩功效。評價結果為無舒緩功效,則需用結合其他試驗方法進一步確認。9試驗報告試驗報告至少應給出以下方面的內容: