腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性檢測試劑盒（微量法）原理腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucosepyrophosphorylase，AGP，EC1)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與ATP反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。CheKine?腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測植物組織樣本。在該試劑盒中，AGP催化的逆向反應(yīng)生成G1P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測定NADPH增加速率，即可計算AGP活性。包裝清單試劑盒組分規(guī)格儲存條件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃ReagentⅠ3mL6mL4℃ReagentIIAPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存ReagentIIBPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存注意：正式檢測前，建議選擇2-3個預(yù)期差異較大的樣本進(jìn)行預(yù)實驗。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外光分光光度計（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：ExtractionBuffer有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實驗。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。WorkingReagentII：臨用前配制；將ReagentIIB轉(zhuǎn)移至ReagentIIA瓶中，48T加入5.4mL去離子水，96T加入10.8mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復(fù)凍融。ReagentIII：臨用前配制；48T加入0.8mL去離子水，96T加入1.6mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復(fù)凍融。ReagentIV：臨用前配制；48T加入0.8mL去離子水，96T加入1.6mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復(fù)凍融。ReagentV：臨用前配制；48T加入0.8mL去離子水，96T加入1.6mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復(fù)凍融。WorkingReagent：每孔準(zhǔn)備35μL工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。按ReagentIII：ReagentIV：ReagentV=1：1：1的比例配制，混合均勻。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應(yīng)控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。注意：1.如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3002的蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1372的測定。實驗步驟酶標(biāo)儀或紫外光分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，紫外光分光光度計用去離子水調(diào)零。ReagentⅠ置于30℃孵育10min。操作表（下述操作在1.5mLEP管中操作）：試劑測定孔（μL）樣本10ReagentⅠ50WorkingReagentII80混勻，30℃保溫15min，置沸水浴中1min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，4,000g，4℃離心5min，取上清液。下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作：上清液80CooledReagentⅠ85WorkingReagent35充分混勻，立即記錄340nm處10s時吸光值A(chǔ)1和130s時的吸光值A(chǔ)2。計算ΔA=A2-A1。注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果ΔA小于0.02可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA大于0.6，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。若ΔA出現(xiàn)負(fù)值，則說明樣本中不含AGP或已降解。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎剑ㄍ茖?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。AGP活性的計算使用96孔UV板測定的計算公式如下按樣本蛋白濃度計算：酶活單位定義：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。AGP(U/mgprot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T×1.75=5,627×ΔA÷Cpr按樣本鮮重計算：酶活單位定義：每克樣本每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。AGP(U/g鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1.75=5,627×ΔA÷WV反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，2min；1.75：稀釋倍數(shù)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。使用微量石英比色皿測定的計算公式將上述計算公式中光徑d：0.5cm調(diào)整為d：1cm進(jìn)行計算即可。注意事項在96孔UV板或微量石英比色皿中的操作，建議使用冷卻至室溫的ReagentⅠ，否則將會造成讀數(shù)背景高。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗對樣品進(jìn)行檢測。Figure1.本試劑盒測定南瓜和玉米種子中AGP的活性。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1371CheKine?淀粉含量檢測試劑盒（微量法）KTB1372CheKine?可溶性淀粉合成酶（SSS）