實驗二、動物細胞蛋白質的提取和含量測定

2014.9.27

主要內容概述實驗目的實驗內容實驗原理試劑與器材操作流程概述蛋白質是生命現象的物質基礎之一，是生物體最重要的組成部分。因此，對蛋白質的結構與功能研究，是生命科學的核心問題。要研究蛋白質的結構與功能，往往從細胞中提取蛋白質開始，而對蛋白質含量的測定則是蛋白質相關研究中的必備技術。蛋白質的定性、定量分析是臨床診斷疾病的最重要技術手段：比如體檢血清白蛋白，甲胎蛋白水平。生物制品、食品質量檢測的手段，比如牛奶中總蛋白含量。因此，對蛋白樣品進行準確可靠的定性定量分析，是一項非常重要的工作。蛋白質定性分析

(qualitativeanalysis)

確定樣品中是否有蛋白質存在，以及存在的是何種蛋白質

蛋白質定量分析

(quantitativeanalysis)

確定樣品中總蛋白含量，或者某種單一蛋白成分的含量實驗目的學習掌握從動物樣品中提取細胞總蛋白的基本方法掌握三種常用的蛋白質定量分析方法，并了解各自的優缺點實驗內容小鼠肝臟細胞蛋白質的提取三種蛋白質含量的測定方法實驗原理

（一）小鼠肝臟細胞蛋白的提取1.材料的選擇：動物肝臟細胞比較脆弱，易于破碎，故本實驗選用小鼠肝臟細胞作為實驗材料。2.提取方法的選擇：采用勻漿法將其破碎，然后加入樣品提取液使蛋白質溶解，用高速離心法棄去細胞碎片。收集上清液后可進行蛋白質定量分析。3.如何提取高質量的蛋白蛋白質提取中最常見的問題是目的蛋白質發生變性和被蛋白酶降解。基本的防范措施：盡可能縮短提取時間和在盡可能低溫下提取。為了防止蛋白酶的破壞，可在提取液中加入蛋白酶抑制劑。例如:加入苯甲磺酰氟（PMSF）可以抑制絲氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制劑，可抑制酸性蛋白酶；乙二胺四乙酸（EDTA）可抑制金屬蛋白酶。防止蛋白變性：

為了防止蛋白質的巰基發生氧化，可加入一定量的還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇。考慮到溶液中如存在重金屬離子（如鋁、銅、鐵離子）可能會與蛋白質形成不溶復合物，可在溶液中加入一定濃度的EDTA。（二）蛋白含量的測定方法蛋白質含量的測定方法有很多種物理性質：紫外分光光度法化學性質：目前蛋白質的含量測定常用的方法有定氮法、雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）染色性質：考馬斯亮藍法（Bradford法）其中Bradford法和Lowry法靈敏度較高，比紫外吸收法靈敏高10～20倍，比Biuret法靈敏100倍。測定方法的選擇：上述這些方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質，因為一種蛋白質溶液用這幾種方法測定，有可能得出幾種不同的結果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優缺點。在選擇方法時應考慮：①實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質的性質；③溶液中存在的干擾物質；④測定所要花費的時間。1.Lowry法

首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色，這種深藍色的復合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比，可根據750nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量所需時間40min優點一種可靠的蛋白質定量方法不同蛋白質之間差別很小缺點某些試劑不穩定靈敏度5ug/ml～100ug/ml干擾物質多：K+,Na+等離子，蔗糖，甘油，EDTA等都影響測定反應速度慢使蛋白質發生不可逆變性2.考馬斯亮蘭法考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在一定范圍內，考馬斯亮蘭G250-蛋白質復合物在595nm下，吸光度與蛋白質含量呈線性關系。故可以用于蛋白質含量的測定。優點快速（反應時間僅需3min）敏感，幾乎沒有蛋白質損失缺點用這種測定方法對蛋白質引起不可逆的變性靈敏度

1ug/ml～10ug/ml

由于不同蛋白的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，所以該方法測定不同的蛋白質會有偏差一些化合物干擾反應，比如TritonX-100,SDS,0.1N的NaOH3.紫外分光光度法蛋白質中普遍含有酪氨酸與色氨酸，由于這兩種芳香族氨基酸分子中含有大π鍵，它們在280nm紫外光附近有光吸收。因而使蛋白質在上述紫外波長附近產生較強的光吸收，利用蛋白質的這一特性可對其進行含量測定。芳香族氨基酸的紫外吸收優點快速缺點核酸可引起強干擾作用靈敏度

相對較低對蛋白質無破壞性（蛋白純化實時監測）不是嚴格的定量，適用于測定蛋白質粗提液測定所需時間幾分鐘操作步驟1．用頸椎脫臼法處死小鼠，切開腹腔，取下完整肝臟，小心去掉膽囊（不要弄破），放入盛冷生理鹽水的燒杯中漂洗干凈。2．取小鼠肝組織0.5g，在濾紙上剪碎，放入玻璃勻漿管中。3．按1：15的比例往玻璃勻漿管中加入勻漿緩沖液（即每份樣品需加預冷的提取緩沖液7.3mL，蛋白酶抑制劑0.2mL），手動勻漿。注意用力均勻，以免損壞勻漿管。4．勻漿完成后，取兩只1.5mL

eppendorf管，各加入1.2mL勻漿液后，置入冷凍離心機中。5．于4℃，13000rpm離心20分鐘后，小心取出上清液至1.5mL

eppendorf管中，上清液需低溫保存，作為待測樣品備用。Lowry法取16mm*150mm試管16支，標明號碼，放置在試管架，在1～6號試管內分別加入標準牛血清白蛋白（使用時取貯液用雙蒸水稀釋至0.5mg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，用雙蒸水補足至每管總體積0.5mL，在7、8號試管內分別加入待測樣品25、50μL，并用雙蒸水補足至0.5mL（即將待測樣品稀釋20或10倍）。9～16號重復1～8號。各管加入2.5mL新配制的堿性銅溶液，立即搖勻，在室溫下放置10min。各管加入0.5mL

Folin酚試劑應用液，邊加入邊立即充分混合（用震蕩混合器），然后在室溫下放置30～60min（不要超過60min）。將標準樣品及待測樣品在可見光光度計上在550nm波長下比色。根據已知含量的標準樣品測得的吸光度做標準曲線，然后根據待測樣品的吸光度在標準曲線上查出其蛋白質含量。根據稀釋倍數計算出小鼠肝臟提取液的蛋白質含量。考馬斯亮蘭法測定蛋白質濃度取16mm*150mm試管16支，標明號碼，放置在試管架，在1～6號試管內分別加入標準牛血清白蛋白（使用時取貯液用雙蒸水稀釋至0.5mg/mL）0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mL，用雙蒸水補足至每管總體積0.1mL，在7、8號試管內分別加入稀釋20、10倍的待測樣品0.1mL。9～16號重復1～8號。每管加入考馬斯亮蘭G250染料試劑3mL,搖勻，室溫靜置3分鐘。分光光度計于波長595nm比色。根據已知含量的標準樣品測得的吸光度做標準曲線，然后根據待測樣品的吸光度在標準曲線上查出其蛋白質含量。根據稀釋倍數計算出小鼠肝臟提取液的蛋白質含量。紫外吸收法測定蛋白質濃度取16mm*150mm試管16支，標明號碼，放置在試管架，在1～6號試管內分別加入標準牛血清白蛋白（2mg/mL）0、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9mL，用雙蒸水補足至每管總體積3mL，在7、8號試管內分別加入稀釋100、50倍的待測樣品3mL。9～16號重復1～8號。以1號管為參比，用紫外分光光度計于波長280nm處比色。根據已知含量的標準樣品測得的吸光度做標準曲線，然后根據待測樣品的吸光度在標準曲線上查出其蛋白質含量。根據稀釋倍數計算小鼠肝提取液的蛋白質含量。1.加入RNase除RNA是在加入蛋白酶消化液之后進行的，那么RNase不會被剩余的蛋白酶消化液破壞嗎？2.加入蛋白酶消化液不是已經破壞了蛋白質了嗎，那么為什么加入苯酚-氯仿之后還會有這么多可以看得到的一層蛋白質？3.異戊醇是用來減少產生的氣泡的，為什么會有氣泡產生呢？4.加入蛋白酶消化液之后，為什么要在50度保溫，是因為這種蛋白酶的最適溫度是50度嗎？5.加入酚-氯仿