菌種保藏冷凍干燥管的制備河北科技大學生物科學與工程學院河北省發酵工程技術研究中心徐親民2水分在冰凍狀態下直接升華而干燥冷凍干燥的三要素：真空——降低水的蒸汽壓以加速水分的蒸發冷凍——使水蒸氣冷凝以減輕真空泵負荷,加速干燥溫度——達到進一步加速干燥的目的冷凍干燥的優點：對微生物的生物活性影響小所得干粉疏松，溶解性好水分含量低由于同時滿足干燥和真空兩個菌保要素,因而保存時間長,保存過程不易失活和退化冷凍干燥原理3取質地均勻、厚實(壁厚1

mm)、無毛點、無氣泡的硬質玻璃專用菌種冷凍管（圖1），清洗干凈后在管內放置打印有菌種簡略名稱和編號的紙條標簽（圖1左邊的單管式冷凍管置于熔封區和裝液區之間，右邊的套管式冷凍管置于內外管之間），單管式冷凍管管口和套管式冷凍管內管管口插入纏繞松弛的棉簽，用牛皮紙包裹，于121℃滅菌30分鐘，取出置37℃孵育24小時，重復滅菌一次，105~110℃烤干（有硅膠指示劑的要使硅膠達到深藍色），置干燥器內備用。冷凍管的準備4圖1用于冷凍干燥菌種的兩種冷凍干燥管推薦尺寸：(左)Φ8×100，璧厚1mm，球徑12

mm；(中、右)外管Φ12×100，璧厚0.8-1mm；內管Φ9×50，壁厚0.5

mm。棉塞熔封區放標簽處裝液區外管熔封區棉塞內管放標簽處變色硅膠棉塞6選生長飽滿且無菌檢查合格的新鮮菌種斜面或米孢子，加入適量滅菌脫脂牛奶(一般每支中試管斜面加10ml脫脂牛奶，或每10ml脫脂牛奶中加1g米孢子粒)，用自制接種耳(圖2)將斜面上的菌苔輕輕刮下(注意不要刮壞瓊脂表面)，或在強力振蕩器上將米孢子粒上的孢子震落，搖勻，用滅菌吸管或長針注射器吸出牛奶菌懸液，置于預先滅菌的空試管內。以上操作應在無菌室內的超凈工作臺上進行。菌懸液的制備7圖2自制接種耳和長嘴毛滴管不銹鋼絲木柄玻璃毛滴管橡皮頭8將牛奶菌懸液用長針注射器或長嘴毛滴管(圖2)分裝入滅菌冷凍管內(注意不要使牛奶玷污紙條標簽)，視冷凍管的大小每只0.3~0.5ml

(單管式冷凍管球形裝液區內的裝液量應為球體積的一半左右，套管式冷凍管內管的裝液高度與管直徑相當)，取出棉簽棒，留置棉花，置于冷凍干燥機內冷凍干燥24小時左右。冷凍干燥機要先開機預冷30分鐘以上再開泵。根據設備情況，有的在冷凍干燥前還要先用液氮或干冰對菌懸液進行預凍。另外，要根據冷凍干燥機的水分蒸發能力，確定一次放入的冷凍管數量。冷凍干燥9確認菌懸液是否已經干燥的方法是一看真空度，二看冷凍室溫度。當水分已經蒸發完，即水蒸汽分壓接近零時，真空度將達到最高值而不再上升；由于蒸發是一個吸熱過程，在整個冷凍干燥過程中冷凍室的溫度將會維持很低，使菌懸液一直處于凍結狀態，當沒有水分的繼續蒸發后，冷凍室不再吸熱，溫度開始自然上升。確認干燥后，要先開啟冷凍室的進氣閥，讓真空釋放，然后停泵，打開冷凍室，將冷凍干燥管取出。為了確保冷凍干燥管內的菌粉不被污染，在冷凍室進氣口應裝有空氣過濾器。干燥的確認和停機10用自制簡易冷凍干燥機進行冷凍干燥管的冷凍干燥，效果優于外購冷凍干燥機。制作方法如下：自制兩只1升左右的不銹鋼缸子，一只作為真空冷凍干燥室，另一只作為冷凝室，在兩個缸子的齊口處焊接寬邊不銹鋼圈，上面有一只能連接真空泵的加厚透明有機玻璃蓋(便于觀察內部)，用硅橡膠圈使缸子與缸蓋密封。另外買一只2~3升的不銹鋼真空保溫桶，作為液氮罐(最好是專用液氮罐)，其口徑應能使上述缸子坐入保溫桶，而鋼圈架在桶沿上(圖3和圖4)。簡易冷凍干燥機的制作11圖3自制簡易冷凍干燥機(方案一)至真空泵真空保溫桶(液氮罐)液氮冷凍真空室(放冷凍干燥管)硅橡膠密封圈進氣閥冷凝室厚壁軟管真空表12圖4自制簡易冷凍干燥機(方案二)至真空泵真空保溫桶(液氮罐)液氮冷凍真空室(放冷凍干燥管)硅橡膠密封圈進氣閥冷凝室真空表注：冷凍真空室夏天由室溫加熱，冬天可在外壁纏繞加熱帶，控溫30~40℃。13操作前，將冷凍干燥室和冷凝室清洗干凈，控干后用酒精棉擦拭冷凍干燥室內腔，然后在頂蓋上的進氣管內塞入棉花，關閉進氣閥門，連接好真空管線，將冷凝室座入加滿液氮的保溫桶內，先把冷凍干燥管放入冷凝室內預凍30分鐘，移入冷凍干燥室，開啟真空泵，進行冷凍干燥。冷凍管內菌懸液確認干燥后，緩慢開啟冷凍干燥室的進氣閥，釋放真空，關真空泵，取出冷凍干燥管進行真空熔封。這一簡易冷凍干燥機也可用于其他生物樣品以及對熱不穩定的水溶性化學和生化樣品的凍干。簡易冷凍干燥機的操作14冷凍干燥后的冷凍管取出后，立即插入多歧管（圖5）的連接硅膠管內，連接并開啟高真空泵，確認達到最大真空后，在繼續抽真空下用煤氣噴燈或天然氣噴燈或丁烷氣噴燈對準冷凍管的熔封區熔融封口，用電火花槍檢查真空度合格后放4℃冰箱保存。這一封口過程技術難度較大，需要有經驗的技術人員或技工去操作。手工封口15圖5

手工真空熔封冷凍干燥管的多歧管真空表閥門抽真空連接冷凍管的硅膠管16利用一邊抽真空一邊旋轉的安瓿真空封口機，可以高質量地將冷凍干燥后的菌種管真空封口。這種安瓿真空封口機如圖6所示。操作步驟如下：將燃氣瓶上的燃氣軟管與燃氣連接口連接（設備后面混合三通右下方針型調節閥連接口）將待熔封的安瓿插入安瓿夾具（配重夾具），輕輕旋緊螺旋夾，加上適當重量的配重砝碼。調節真空頭的高度，使其與安瓿口的距離約25mm。抬高安瓿和配重夾具，使安瓿口與真空頭相連。插好電源插頭，開啟電源開關，真空泵和帶動真空頭旋轉的單相電機同時啟動。開啟真空轉換開關，使真空與安瓿連通，安瓿在旋轉狀態下抽真空。機器封口（一）17轉動燃氣噴頭使其離開安瓿，慢慢地開啟燃氣針型閥，用打火機點燃燃氣。開啟氣泵開關，分別調節空氣調節閥和燃氣調節閥使火焰大小適中并呈藍色。調節燃氣噴頭的位置，使兩束火焰尖頭指向安瓿熔封位置。火焰很快將安瓿燒軟，并在配重夾具重力的作用下拉伸，同時在真空的作用下收縮，最終完全熔封并被拉斷，從而完成自動熔封過程。將熔封后的安瓿從夾具上取下，把熔封拉斷處的尖頭置于火焰上燒圓并退火。關閉真空轉換開關，切斷真空與安瓿的連通，用鑷子取下真空頭上的安瓿殘端，插上新的安瓿，開始第二輪熔封。機器封口（二）18圖6立式真空熔封機19圖7臥式真空熔封機20立式機使用配重砝碼的重量以在旋轉抽真空狀態下安瓿不從真空吸頭上脫落為限；臥式機安瓿口與真空吸頭的距離以安瓿夾牢后所能拉伸的距離為限，大約為30-40

mm。如果安瓿口太小，不能將真空頭插入，可在安瓿口上套一根20mm左右長的硅膠管，再與真空頭連接；手持燃氣噴燈應使高溫焰對準熔封部位，并隨著安瓿的拉伸向安瓿端移動，以免安瓿端拉絲過長熔封后容易碰斷；安瓿真空熔封機使用注意事項(一)21燃氣噴燈的點火、調溫、熄火、充氣操作應嚴格按噴燈所附說明書進行；熔封好的安瓿不能倒放在冰涼的桌面上，以免驟冷爆裂，應當插入特制的安瓿架；千萬不要用手去取下真空頭上的安瓿殘端，以免燙傷；工作結束后關閉燃氣噴燈，放在安全并遠離火源的地方。安瓿真空熔封機使用注意事項(二)22外觀檢查：冷凍干燥結束后，冷凍管內干燥物成疏松的固體團塊，體積應保持與原液體體積相同，而且在長時間保存后不收縮，變色硅膠呈深藍色。另外，每個月還要對冷凍干燥管定期檢