ICS65.020.30

CCSB45

12

天津市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB12/T1190—2023

牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鑒別技術(shù)

規(guī)程

CodeofpracticeforidentificationofA2typeofβ-casein(A2milk)incow'smilk

2023-04-07發(fā)布2023-05-07實(shí)施

天津市市場(chǎng)監(jiān)督管理委員會(huì)??發(fā)布

DB12/T1190—2023

牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鑒別技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了的牛奶中A2型β-酪蛋白（A2奶）的檢測(cè)原理、主要試劑配制、主要儀器設(shè)備、質(zhì)譜檢

測(cè)及數(shù)據(jù)處理參數(shù)、檢測(cè)方法、結(jié)果判定、廢棄物的處理和檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施。

本文件適用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法

GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

A2型β-酪蛋白A2β-casein；A2CSN2

β-酪蛋白由209個(gè)氨基酸組成，其一級(jí)序列中的第67位氨基酸的種類(lèi)為脯氨酸（Proline,P）時(shí)，

稱(chēng)為A2型β-酪蛋白。

3.2

A2奶A2milk

所含β-酪蛋白為A2型的牛奶。

3.3

質(zhì)荷比mass-to-chargeratio

離子的質(zhì)量m與其所帶的電荷數(shù)z之比，以m/z表示。

4檢測(cè)原理

β-酪蛋白變體型對(duì)應(yīng)的氨基酸突變位點(diǎn)為第67位組氨酸（Histidine,H）突變?yōu)楦彼幔≒roline,

P），不同氨基酸之間存在分子量差異。利用質(zhì)譜分析技術(shù)，根據(jù)差異肽段的分子量及質(zhì)荷比差異將樣

品蛋白質(zhì)中存在氨基酸突變的肽段鑒定出來(lái)，從而確定氨基酸突變位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同突變體型β-酪蛋白

檢測(cè)的目的。

5試劑配制

實(shí)驗(yàn)所用水為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水；高壓滅菌條件為121℃，1.034*105Pa壓力，蒸汽滅菌

20min。試劑配制如下：

1

DB12/T1190—2023

——樣品裂解液：將480.4g尿素，7.1gHEPES溶于800mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至1L；

——10%SDS（十二烷基硫酸鈉）：將10gSDS粉末溶于80mL蒸餾水中，加熱至68℃助溶，用

HCl調(diào)pH至7.2，定容至1000mL，0.2μm的濾膜過(guò)濾，高壓滅菌；

——30%丙烯酰胺：將29g丙烯酰胺和1gN,N'-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60mL的蒸餾水中，

充分溶解后，定容至100mL；

——1.5mol/LTris-HCl（pH=8.8）：將181.65gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調(diào)pH至8.8，

容至1000mL；

——1mol/LTris-HCl（pH=6.8）：將121.1gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調(diào)pH至6.8，容

至1000mL；

——10%過(guò)硫酸銨：將10g過(guò)硫酸銨粉末溶于80mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL；

——考馬斯亮藍(lán)染色液：量取甲醇45mL，蒸餾水45mL，冰乙酸10mL，加入0.25g考馬斯亮藍(lán)

R-250；

——考染脫色液：50mL碳酸氫銨/乙腈=1：1；

——1μg/μL胰蛋白酶：將100μg胰蛋白酶溶解到100μL50mmol/L乙酸中，-70℃儲(chǔ)存；

——25mmol/L碳酸氫銨：將2.0碳酸氫銨溶于800mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至1L。

6儀器設(shè)備

6.1單道可調(diào)移液器

0.25～2.5μl、1～10μl、2～20μl、5～50μl、10～100μl、20～200μl、100～1000μl。

6.210K超濾管

超濾管截留蛋白分子量：30～90KDa。

6.3離心機(jī)

最高轉(zhuǎn)速12000r/min，最大容量24×1.5mL。

6.4電子天平

萬(wàn)分之一精度。

6.5凝膠成像分析系統(tǒng)

有膠像素1280×1024，檢測(cè)靈敏度DNA≥0.05ng。

6.6穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀

輸出電壓0～600V，輸出電流0～100mA。

6.7垂直電泳槽

外形尺寸15cm×12cm×13cm，凝膠板面積10cm×10cm。

6.8高壓滅菌鍋

使用溫度范圍45～135℃，最高使用壓力0.255Mpa。

6.9自動(dòng)雙重純水蒸餾器

2

DB12/T1190—2023

功率3000W，出水量2500mL/h。

6.10微波爐

功率700W，容積20L。

6.11冰箱

4℃，-20℃。

6.12電熱恒溫水浴鍋

RT+5～70℃

7質(zhì)譜檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理參數(shù)

應(yīng)按照附錄A執(zhí)行。

8檢測(cè)方法

8.1樣本采集

每頭奶牛采集新鮮牛奶（排除頭奶和末乳）50mL，充分混勻后，-80℃保存。

8.2蛋白提取

8.2.1從-80℃取出牛奶樣本，常溫解凍后充分混勻，取樣50μL。

8.2.2向上述樣品中加入500μL裂解液[8mol/L尿素，30mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）]。

冰上裂解10min。4℃，20000g，離心30min。取上清，避免吸到油脂。

8.2.3加入二硫蘇糖醇（DTT）至終濃度10mmol/L。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）

至終濃度55mmol/L，暗室靜置1h。

8.2.4使用考馬斯藍(lán)染色法（Bradford法）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。

8.2.5對(duì)定量后的蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分析（如附錄C.1）。

8.3蛋白質(zhì)的消化

8.3.1取8.2.5中蛋白20μg，加入到10K超濾管中，14000g，4℃，離心40min，棄廢液。

8.3.2加入200μL的25mmol/L碳酸氫銨（NH4HCO3），14000g，4℃，離心40min，棄廢液。

8.3.3重復(fù)8.3.2步驟兩遍。

8.3.4加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。離心

收集消化后的肽段。

8.3.5真空抽干消化后的肽段。

8.3.60.1%甲酸（FA）復(fù)溶肽段。

8.4質(zhì)譜鑒定

8.4.1將8.3.5提取的酪蛋白肽段進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。使用高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)獲得

的酪蛋白肽段進(jìn)行分離并檢測(cè)，液相及質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1～表3。

3

DB12/T1190—2023

表1液相色譜柱參數(shù)

項(xiàng)目參數(shù)

色譜柱WatersXbridgeBEH300C18(100mm×2.1mm3.5μm)

流動(dòng)相A0.2%甲酸-水(v/v)

流動(dòng)相B0.2%甲酸乙腈(v/v)

柱溫箱40℃

流速0.3mL/min

進(jìn)樣體積5μL

表2液相色譜流動(dòng)相洗脫梯度

時(shí)間（分）B液比例

02%

22%

510%

2040%

2295%

2595%

25.12%

282%

表3質(zhì)譜檢測(cè)-離子源參數(shù)

參數(shù)名稱(chēng)參數(shù)值

離子模式正離子模式

母離子掃描范圍50-2000m/z

二級(jí)分辨率30000

離子源溫度500

離子化電壓5500V

采集模式數(shù)據(jù)依賴(lài)型采集(Independentdataacquired,IDA)

碰撞能量35±15V

氣簾氣氮?dú)?5psi

霧化氣氮?dú)?0psi

輔助加熱氣氮?dú)?0psi

8.4.2對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、峰提取和篩選，確定特征性肽段。質(zhì)譜掃描完畢，得到質(zhì)譜原始文件，

將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入后，進(jìn)行一級(jí)色譜峰的濾噪、峰提取、篩選出含有p.67位氨基酸的特征肽段，

4

DB12/T1190—2023

篩選參數(shù)見(jiàn)表4。

表4質(zhì)譜峰篩選參數(shù)

參數(shù)名稱(chēng)實(shí)驗(yàn)選項(xiàng)

母離子質(zhì)量范圍50-2000Da

質(zhì)量偏差寬度0.02Da

0.2min

保留時(shí)間偏差

信噪比S/N域值3

8.4.3篩選后的差異性肽段用Proteinpilot軟件進(jìn)行差異肽段序列的比對(duì)和鑒定，檢索參數(shù)見(jiàn)表5。

表5鑒定檢索參數(shù)

參數(shù)名稱(chēng)參數(shù)條件

烷基化試劑碘乙酰胺

可變修飾Oxidation(M),Gln→Pyro-Glu(N-termQ)

Phospho(ST),Ser→Arg(S),Ser→Lys(S),Arg→Cys(R),Gln→Glu(Q),

Glu→Lys(E),Met→Leu(M),Pro→His(P),Pro→Leu(P),His→Gln(H)

質(zhì)量偏差0.35Da

最大允許漏切數(shù)1

酶的類(lèi)型(Enzyme)Trypsin

置信度(FDR)>95%

數(shù)據(jù)庫(kù)(Database)/_Bostaurus

9結(jié)果判定

9.1SDS鑒定

將從樣品中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS分離鑒定，檢測(cè)蛋白條帶是否清晰無(wú)降解。條帶清晰，表示

可用于后續(xù)檢測(cè)，否則重新取樣鑒定，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

5

DB12/T1190—2023

圖1SDS檢測(cè)結(jié)果（紅框內(nèi)條帶為β-酪蛋白）

9.2A2型β-酪蛋白的判定

根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，當(dāng)待測(cè)樣品的