ICSXX.XXX

XXX

團體標準

豬偽狂犬病毒gE蛋白間接磁微粒

CLIA抗體檢測方法

Indirectmagneticparticlebasedchemiluminescence

immunoassayfordetectingantibodiesagainst

PseudorabiesVirusgEGlycoprotein

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關專利連同支持性文件一并附上。

20XX-XX-XX發布20XX-XX-XX實施

中國獸醫協會發布

T/CVMAXX-20XX

豬偽狂犬病毒gE蛋白間接磁微粒CLIA抗體檢測方法

1范圍

本文件規定了豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體管式化學發光免疫分析檢測方法的試劑、儀器設備、耗材、

操作步驟、結果判定。

本文件適用于定量檢測豬血清中偽狂犬病毒gE蛋白的特異性抗體，并且實現自動化、高通量、高敏

感性、高重復性檢測。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范

GB/19489樣品處理的生物安全措施、實驗室生物安全通用要求

中華人民共和國農業部公告第302號獸醫實驗室生物安全管理規范

中華人民共和國主席令第五十六號《中華人民共和國生物安全法》

GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法

GB/T18641-2018偽狂犬病診斷方法

中華人民共和國國務院令第424號《病原微生物實驗室生物安全管理條例》

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件

CLIA:化學發光免疫分析法（ChemiluminescenceImmunoassay）

1

T/CVMAXX-20XX

ELISA：酶聯免疫吸附（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）

5試劑

5.125×濃縮洗液洗液，按照附錄A.1配置

5.2樣本稀釋液，按照附錄A.2配置

5.3磁微粒工作液（偶聯豬偽狂犬病毒gE蛋白抗原的磁微粒懸浮液）

5.4稀釋液，同樣本稀釋液，按照附錄A.2配置

5.5酶標抗體工作液（堿性磷酸酶標記兔抗豬IgG）

5.6豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體工作校準品：包括工作校準品1、工作校準品2、工作校準品3、工作

校準品4、工作校準品5、工作校準品6，抗體含量分別為0U、10U、20U、40U、80U、320U，按照附

錄B制備

5.7豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體校準品：包括產品校準品1、產品校準品2、抗體含量分別為20U、

80U，按照附錄C.1制備

5.8豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體質控品：質控品1抗體含量≤15U，質控品2抗體含量范圍應為40U～

65U，按照附錄C.2制備。

5.9化學發光底物。

6儀器設備及耗材

實驗操作所需設備及耗材如下：

—全自動化學發光免疫分析儀：磁微粒和酶促化學發光檢測設備，LYC100、LYC200等。

—電子天平：最大稱量：Max=220g；最小稱量：Min=10mg；顯示分度值：d=0.1mg

—離心機：最高轉速：16000rpm。

—可調單道移液器（100μL、1mL）

—1.5mL尖底離心管

—反應杯

—試劑船

7技術原理

2

T/CVMAXX-20XX

本方法使用磁微粒化學發光免疫分析法，采用間接法原理，將豬偽狂犬病毒gE蛋白作為抗原偶聯于

3μm羧基磁微粒上，加入待檢血清進行抗原抗體結合；再加入酶標抗體進行反應；最后加入化學發光底

物，讀取發光值，待檢樣本抗體含量和發光值呈正相關。本方法通過檢測豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體工作

校準品建立校準曲線，并通過校準曲線計算待檢樣本中豬偽狂犬病毒gE蛋白的抗體含量，判定陰陽性結

果。

8檢測前準備

8.1樣品采集及保存

樣品采集按照NY/T541進行。無菌注射器靜脈采血，不少于2mL，用自然析出法分離血清后，置于

無菌血清管中，按照GB/19489樣品處理的生物安全措施、實驗室生物安全通用要求處理樣本，若在一

周內檢測，可置2℃~8℃條件下保存，若超過一周檢測，應置于-20℃以下冷凍保存。

血清樣本運輸時應注意2-8℃冷藏。按照《獸醫實驗室生物安全技術管理規范》、《中華人民共和

國生物安全法》進行樣品的生物安全操作和標識。

8.2樣品處理

取8.1中的樣品，8000r/min，離心2min，取上清放于1.5mL離心管中，體積應大于300μL，待檢；

若樣品中存在沉淀或絮狀物等雜質，應離心去除雜質，輕微操作，避免出現泡沫。

8.3溶液配制

洗滌液：將25×濃縮洗液用無離子水或蒸餾水1:25倍稀釋（如：25×濃縮洗液+水=100mL+2400mL），

裝入洗滌液桶。

無離子水或蒸餾水均應符合GB/T6682的要求。

8.4儀器準備

閱讀儀器說明書，放置反應杯，掃碼放置底物、系統維護液，開始自檢。

8.5試劑準備

將偶聯磁微粒工作液、酶標抗體、稀釋液，分別裝入試劑船上對應試劑瓶中，將磁微粒吹打混勻、

試劑船瓶蓋換為膠蓋；然后將試劑船裝入試劑倉中。

3

T/CVMAXX-20XX

9操作步驟

9.1校準曲線擬合

將豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體工作校準品1～工作校準品6放入樣本架，按照9.4進行樣品檢測，按9.5

制作校準曲線并計算。校準曲線見附錄D。

9.2校準曲線校準

將豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體產品校準品1和產品校準品2放入樣本架，按儀器說明書對校準曲線進行

校準。

以下情況需對校準曲線進行校準，然后再進行檢測：

a)試劑成分發生改變；

b)同一批次試劑盒使用周期超過28d；

c)根據具體需要：如質控結果不符合要求。

9.3質控

需要時檢測質控血清，檢測值必須在參考范圍內，方可繼續樣品檢測。

如下情況需檢測質控血清：

a)試劑成分發生改變或校準曲線校準后后；

b)質控樣品至少24h內需檢測1次。

9.4樣品檢測

取待檢樣本于1.5mL/2mL離心管中（樣本量需300μL以上），置于專用樣品架，設置測試樣品信

息，進行檢測。

整個檢測過程在LYC100T及LYC系列全自動化學發光免疫分析儀上全自動進行，具體檢測過程如

下：

a)免疫反應：取20μL待測樣本，25μL磁微粒工作液、55μL稀釋液，分別加入反應杯中，37℃孵

育10min；

b)清洗：使用磁鐵吸附磁微粒30s，使其聚集于管壁，棄去上清液。加入1×洗滌液300L懸浮磁微

粒，混勻30s后吸附磁微粒，棄去1×洗滌液。重復清洗4次。

4

T/CVMAXX-20XX

c)免疫反應：取100μL酶標二抗加入反應杯中，37℃孵育10min；

d)同c)

e)檢測：加入化學發光底物溶液100L于清洗后的反應杯中，混勻30s懸浮磁微粒，37℃反應3分

鐘，檢測發光值（RLU）。

f)計算：將發光值（RLU）代入校準曲線，計算樣本中的抗體含量。

9.5計算結果

檢測完成后，以工作校準品抗體含量（0U、10U、20U、40U、80U、320U）為橫坐標、相應檢

測發光值為縱坐標擬合四參數為校準曲線，四參數模式為Y=(a-d)/[1+(x/c)*b]+d，當R2高于0.99時，可用

于結果計算和判定。將待檢樣品檢測發光值代入校準曲線，計算結果即為待檢樣本中豬偽狂犬病毒gE蛋

白抗體含量。

10結果判定

10.1質控血清參考范圍

質控品1抗體含量≤15U，質控品2抗體含量范圍應為40U～65U，實驗結果成立。

10.2陰陽性判定依據

抗體含量≥35U時，判為豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體陽性；＜35U判為豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體陰

性。

5

T/CVMAXX-20XX

附錄A

(規范性)

試劑的配制

A.125×濃縮洗液，見表A1：

表A125×濃縮洗液配方

名稱稱量

丁二酸1.98g

六水丁二酸鈉62.16g

氯化鈉225.00g

吐溫-2013.75g

加滅菌蒸餾水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存備用。使用時用無菌蒸餾水稀

釋25倍為1×洗液使用。

A.2稀釋液、樣本稀釋液，見表A2：

表A2稀釋液配方

名稱稱量

磷酸氫二鈉1.15g

氯化鈉8.00g

磷酸二氫鈉0.20g

吐溫-200.50mL

加滅菌蒸餾水至600mL溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存備用。蒸餾水均應符合GB/T6682

的要求。

A.3校準品稀釋液

表A3校準品稀釋液配方

名稱稱量

磷酸氫二鈉1.15g

氯化鈉8.00g

磷酸二氫鈉0.20g

牛血清白蛋白1.00g

海藻糖5.00g

吐溫-200.50mL

加滅菌蒸餾水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存備用。蒸餾水均應符合GB/T

6682的要求

6

T/CVMAXX-20XX

附錄B

(規范性)

豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體工作校準品制備

B.1豬偽狂犬病毒gE蛋白高免血清制備

使用豬偽狂犬病毒gE蛋白（深圳重鏈生物科技有限公司）免疫4-6周齡豬偽狂犬病毒陰性豬，按

500ug/頭份劑量，頸部肌肉注射接種。在初次免疫后21天進行加強免疫，14天后檢測抗體水平，如達

不到要求，再進行第三、第四次免疫。

抗體水平達到要求后，采集頸部靜脈血，用自然析出法，3000r/min離心10min，分離血清，然后用

0.22μm濾器過濾除菌，加入proclin300，使終濃度為0.05%（V/V），分裝，-20℃保存備用，操作滿足

生物安全實驗要求（GB/19489-2008）。

抗體水平合格標準：對采集的血清樣品，用ELISA方法檢測抗體水平（GB/T18641-2018），以檢

測樣本為陽性的最大稀釋滴度判為豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體水平。若抗體水平大于1∶4096，則為合格

的原始高免血清。

B.2豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體工作校準品制備

用工作校準品稀釋液梯度稀釋B.1所制備的高免血清，使用ELISA試劑盒檢測，計算檢測結果，

定義ELISA檢測陽性的最大稀釋滴度的稀釋血清抗體含量為10U，若此份血清為1:1024稀釋，則1:512

稀釋血清為20U；1:256稀釋血清為40U，依次類推。工作校準品稀釋液定義為0U，最終選擇0U、

10U、20U、40U、80U、320U分別為工作校準品1、工作校準品2、工作校準品3、工作校準品4、

工作校準品5、工作校準品6，稀釋的工作校準品–20℃保存備用，36個月內有效。

7

T/CVMAXX-20XX

附錄C

(規范性)

豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體產品校準品、質控品

C.1豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體產品校準品制備

取B.1所制備的豬偽狂犬病毒gE蛋白高免血清，用校準品稀釋液稀釋至抗體含量為20U、80U，

分別為豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體產品校準品1、產品校準品2。

C.2豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體質控品制備

取B.1所制備的豬偽狂犬病毒gE蛋白高免血清，用工作校準品稀釋液稀釋至抗體含量為5U、50U，

分別為豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體質控品1、質控品2，用豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體管式化學發光免疫

分析檢測方法檢測5次，計算平均值，質控范圍為Mean±3SD。

8

T/CVMAXX-20XX

附錄D

(資料性)