××××××—××××PAGE1PAGE4發布××××-××-××實施××××-××-××發布高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法ThePCRdetectingmethodofhigh-virulentPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae發布××××-××-××實施××××-××-××發布高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法ThePCRdetectingmethodofhigh-virulentPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaestrain（送審稿）T/××××—xxx團體標準ICS65.150B51備案號：xxxx—xxxPAGEI前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由山東水產學會提出并歸口。本文件起草單位：中國水產科學研究院黃海水產研究所、山東信得科技股份有限公司、山東信達基因科技有限公司。本文件主要起草人：張正、于永翔、王印庚、王春元、羅展、馬廣斌、趙永偉、張世佳、陳偉華。高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法1范圍本文件規定了高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種PCR檢測的引物、儀器設備、試劑耗材、檢測步驟、結果判定、防止交叉污染和廢棄物處理的措施等。本文件適用于高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種菌株的PCR檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求SN/T2102.1食源性病原體PCR檢測技術規范第1部分：通用要求和定義SC/T7014水生動物檢疫實驗技術規范SC/T7015染疫水生動物無害化處理規程SC/T7201.1魚類細菌病檢疫技術規程第1部分：通用技術3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種high-virulentPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae美人魚發光桿菌美人魚亞種（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae，PDD）是弧菌科發光桿菌屬美人魚發光桿菌（Photobacteriumdamselae）的一個亞種，廣泛分布于全球海洋環境中，可以感染魚類、甲殼類、軟體動物、海龜、鯨豚類等不同的海洋動物。該菌種不同菌株因攜帶的毒力基因不同，對宿主呈現出高致病性、低致病性和無致病性。本文件界定的高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種是指感染宿主后能引起發病，最短可在1天內造成魚類等宿主死亡并引發流行性疾病的菌株。4PCR引物4.1hlyB基因的特異引物正向序列hlyB-F:5'-ACTCGCTTACTTGAATCGGAAAT-3'反向序列hlyB-R:5'-TCACGAAAGACATTGAGCATC-3'4.2dly基因的特異引物正向序列dly-F:5'-TTTGGACGAGCGGTCCATTT-3'反向序列dly-R:5'-GGAGCCCAATCTTGACCAGG-3'5儀器設備和試劑耗材5.1儀器設備無菌操作臺、臺式離心機、恒溫金屬浴、PCR儀、漩渦振蕩器、生物安全柜、微量移液器、核酸電泳儀、凝膠成像儀、高壓滅菌鍋等。5.2試劑耗材超純水、2×PCRMix（含dNTP、Mg2+、DNA聚合酶）、SYBRGreenI染料、ROX參比染料、組織裂解液（含1%TritonX-100、2mMEDTA、20mMTris-HCl、0.2%SDS、20mM硫酸銨、1%甜菜堿）、瓊脂糖（電泳級）、DNA分子量標準（DL2000Marker）等試劑。離心管、研磨棒、移液槍頭、PCR管等耗材。6檢測步驟6.1待檢樣品的核酸模板制備參照《SC/T7201.1魚類細菌病檢疫技術規程第1部分：通用技術》和《SC/T7014水生動物檢疫實驗技術規范》的相關規定，檢查待檢病樣的外觀癥狀，并在無菌操作臺中對主要病灶部位進行無菌取樣。隨后剪取0.1g~0.2g病灶部位的組織樣品置于1.5mL離心管中，用研磨棒研磨，加入200μL組織裂解液和300μL滅菌的超純水，充分振蕩混合均勻后，置于恒溫金屬浴上37℃保持5min~10min，使組織充分裂解（也可采用具有同等DNA抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取試劑盒）。隨后，用離心機8000rpm離心2min，獲取上清液，吸取10μL上清液至一個新的無菌離心管中，并加入90μL超純水對上清液進行稀釋，振蕩混勻后即作為待檢樣品的DNA核酸模板。6.2PCR反應體系的配置分別在200μL的PCR反應管中制作兩個獨立的20μLPCR反應體系。其中一個反應體系標記為體系A，含有2×PCRMix混合物10μL，10μM的hlyB基因正向序列引物2μL，10μM的hlyB基因反向序列引物2μL，制備好的DNA模板4μL，加無菌超純水至總體積為20μL。另一個反應體系標記為體系B，含有2×PCRMix混合物10μL，10μM的dly基因正向序列引物2μL，10μM的dly基因反向序列引物2μL，制備好的DNA模板4μL，加無菌超純水至總體積為20μL。分別在A、B兩個反應體系中加入4μL6.1小節中制備好的DNA核酸模板，即完成PCR反應體系的配置。陰性對照反應體系以等體積無菌超純水替代DNA模版。反應體系配置完成后，振蕩均勻并瞬時離心后，迅速將反應管置于PCR儀中。6.3PCR擴增6.3.1PCR反應條件按照如下條件進行PCR反應：95℃預變性2min；95℃變性10s，60℃退火40s，72℃延伸20s，擴增40個循環。隨后，保持72℃延伸10min。6.3.2PCR產物的電泳分別將體系A和體系B的10μLPCR反應產物，以及陰性對照的PCR產物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。6.3.3結果觀察將完成電泳后的瓊脂糖凝膠轉移至凝膠成像儀器中觀察結果，并拍照記錄。7結果判定7.1檢測結果成立的條件體系A的PCR產物電泳后在344bp的位置上出現一條特異性條帶，體系B的PCR產物電泳后在695bp的位置上出現一條特異性條帶，兩個體系的特異性條帶需同時出現且陰性對照PCR產物電泳后均未出現條帶（見附錄A），則檢測結果成立。否則，檢測結果不成立。7.2結果判定7.2.1在檢測結果成立的前提下，檢測結果判定為陽性，即該樣品為高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種感染。7.2.2如果被檢測樣品體系A中的PCR產物電泳后在344bp的位置出現一條特異性條帶，但體系B中的PCR產物電泳后在695bp的位置沒有出現特異性條帶，且陰性對照PCR產物電泳后未出現條帶，則該樣品被美人魚發光桿菌美人魚亞種感染，但該菌株不具有高致病性。7.2.3如果被檢測樣品體系A中的PCR產物電泳后在344bp的位置、體系B中的PCR產物電泳后在695bp的位置都沒有出現特異性條帶，或者被檢測樣品體系A中的PCR產物電泳后在344bp的位置沒有出現特異性條帶，但體系B中的PCR產物電泳后在695bp的位置出現一條特異性條帶，則該樣品不是被美人魚發光桿菌美人魚亞種感染。7.2.4如果陰性對照的相應位置出現特異性條帶，可能是陰性對照存在污染或是實驗過程操作失誤，無論體系A或體系B在相應位置是否出現特異性條帶，均需再次重復進行檢測。上述結果的判定標準可參見表1。表1檢測結果的判定標準體系A（檢測hlyB基因）體系B（檢測dly基因）陰性對照結果判定++-樣品被高致病性PDD感染+--樣品被PDD感染，但不具有高致病性樣品不是被PDD感染-+-+++檢測失敗，需重新進行檢測+-+-++--+8防止交叉污染和廢棄物處理的措施8.1為防止交叉污染所采取的措施應按照《SN_T2102.1-2008食源性病原體PCR檢測技術規范第1部分：通用要求和定義》的相關規定執行。檢測過程中產生的廢棄物應按照《GB19489-2008實驗室生物安全通用要求》的相關規定進行無害化處理。8.2被檢測的病樣樣品在檢測完成后應按照相關規定進行無害化處理。PAGE3附錄A資料性美人魚發光桿菌美人魚亞種不同毒力株PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖圖1美人魚發光桿菌美人魚亞種hlyB基因的PCR產物電泳圖1-25：不同來源美人魚發光桿菌美人魚亞種菌株；26：陰性對照；M：DNA分子量標準。圖2美人魚發光桿菌美人魚亞種dly基因的PCR產物電泳圖1-2：高致病性的美人魚發光桿菌美人魚亞種菌株；3-25：低致病性或無致病性的美人魚發光桿菌美人魚亞種菌株；26：陰性對照；M：DNA分子量標準。附錄B①PDD菌株的hlyB基因全長序列及用于本標準檢測的部分序列（下劃線部分，加粗斜體部分為檢測用引物序列）ATGAATTTAAATCACTTAAGTATTAAGAAAAAACTGATCCTCGCCATGATCAGTGCGGTACTATTTTCTACTGCTCTTGTTGGTATTTTAAGCCAACAACAAGCACGAAAAGTCATTGAAACTCGCTTACTTGAATCGGAAATTCCTGCGACTTTGCTGCAGATTCGCAACCAAATCGATAAAGAAGTTTCCTTGTTGCAAGCAGCGGCACAACAACTGGCAACCAACCCATTAGTGATTGATTCACTCACCGCAACGCTGCCTCAAGATAACACCCAGCTCGTTACCTTACTTAACGAGATCAAGCAGCAATATCATCTATTTGATGCCTCTATTGCGGATCGAAATACAGGAAACTACTGGAACCAAGACGGTTTTTTACGCCAGCTTAACCACCAACAAGATAGCTGGTTCTACAACTTTGTCCGCAGTGGCAACGCTAAGATGCTCAATGTCTTTCGTGAAGCCAATGGTGATGTAAAACTGTTTGTTAATTACCAACAACTCAATGGTAAAGGGCTAGCTGGCTTGTCTAAATCGTTAGATGAAATGGTGCAATTTATTAATCAATTTAAACTTGAGCAAACTGGCTTTGTTTATCTGGTTGATGATAAAGGTATTGTGCGAATTCATAATGATAACCAGTTGATGGGAAAAGCAAGCTTAACCGATTTATACGGTAGCAAGGTGGCAAACCAACTGTTAAAACGAGGCAAAATCGAAATCGTGGATCTTGATCTTGCAGGCCAAGAAAATCTTGTTGCTTCAAGTTATATCCCAACGATGAATTGGTATGTCATCGCCCAATTACCTAAAAATGAAGCGTTTGCGAGCCTCAACCATGCCCGTAATCAAATTTTAATCTGGACTGCCATCATTGCGCTTGGCTTTACTGCGTTAGCGATTTGGCTTGCGAGCTCCATTACCCGTCCAATCGCTCGTTTAGCCGAAATGTTTAAAGATCTTGGTGAAGGTGAAGGCGATCTACGTCATCGTCTAGACATTCAAGGTAACGATGAAATTGCCCAACTGTCCCAAGGCTTTAATGGTTTTATTAGCAAAATCCATAATTCGGTAAAAGAAGTTGCGGAAACAGGAAATGCCCTACGTCACGCCTCTCAATCGGTAGCGGAACAAGCACAAACGACCTTAGATAACAGCCAAAGCCAACGCGATCGCACCATTCAAGTGGTAACCGCGATTAATGAGATGGGGGCAACCGTCAATGAAATTGCAGGTAATGCTGCTCAAGCCGCTGACGCCACTCACCTAGCAGAAACGGAAGCACAAAGTGGTCAACAGGTTGTTGGGCAAGCAAGAGAAACCATTTCACAACTGTCTCATGATGTGGCCCAAGTAAGTGAAGTGATTGAATCTTTGGCCCATAACACCCAAGCCATTGGCAGCATTTTGGATGTGATCCGTGGTATTTCAGAACAAACGAACTTATTGGCATTGAACGCAGCCATTGAAGCAGCTCGTGCTGGTGAGCAAGGTCGTGGTTTTGCCGTTGTTGCTGATGAAGTGCGCAGTCTTGCTAGTCGAACAGCGGCTTCAACTGATGAAATCCAAACTATGATCAACCGTTTACAGCAAGAGGCCAGCAATGCCGTAGCGGCTATCGAGCAAAGTCGCCTGTTAAGTTCCAATGGGGTTTCAGCCTCTGATGAAGCCAGCAGCGCATTGATTTCTATTGCCGAACGTATCACCTTAATTGCAGATATGAATACGCAAGTTGCAACGGCAACAGAAGAACAATCAACAGTGGTTAACGACATCAACTGCAATATCGAAGTGATCAACGAAACCACTCAGCGTACAGCAACCACGGCCGAAGATCTTGCGCAAGCGAGCCTTGAACTGCAGCAATTATCTCACCGATTAGAAGTCATGGTTGGAAGCTTCAAACTTTAA②PDD菌株的dly基因全長序列及用于本標準檢測的部分序列（下劃線部分，加粗斜體部分為檢測用引物序列）ATGAAAATAAAAACGCTTACTATGTTAATTGTGTGCTGCTCCTCAAATGCATATGCTTTTACACAATGGGGAGGTAGCGGTTTAACTCCTATGGGACATGAATGGTTAACGCGAGCCTCAGCTTTAGAGCTTCTTAATTCTGAGGATCTAATAAAGCCAGACCCAGAAGATCCTAGACTTAACTGGACACAAGGCCACGCAAAAAATTTAGATCTTGAAATAGCATCAAATGAAGTATCAAAAATAAAGAATCTAAAAAAAAGTGATAAGCTATACGAACCTAAATATGATGCTATTTTTTCTGCAATTGTTGGTGAACGATGGGTCGATATTGCTGGTTTTAATGTAATAGATGGCTTTATCGGTCAATATGGCCCAGATTGTTTTGATGCGACAGCACAAGAACCAGCAGATCTCCAGCAAGATCATTTCATGCGACGTTATGATGATATCGGAAGCCAAGGAGGCGTTTCTGCAGCAAAAAGAGCTCAAAATCGATTTATTGATCACTTTGTTAATGCTGCAATGGCAAATGAAAAAAGAATATTAGTATGGGATGGTGGAGCATCATCATCAACACAATCTGAAGTAGACTATAATTACTTCTTATTTGGACGAGCGGTCCATTTGTTTCAAGATTCATTTAGCCTAGAGCATACTGTTCGATTACCAGAAGATAATTATAAAAAAATTAGACAAGTCAAAGGATATATTTGTTCTGACAGTTCAGAACAGCATTCTCATAGCAGTTTTACTTCTTCTGATTTCTATGACTCTAATGATGTAATATGGAAGAAAAAATCAAAATCTGATACCGGATGGCAATCATATAAACCAAGTAATATGAAGCCAGCCGCTTTAACTGCACTAGAAGCAAGTAAAGATCTATGGGCTGCTTTTATAAGAACAATGGCAACAAATATTAATGAACGGGAAACTACAGCTAGAAAAGAGGCACAACAATTAATTGATACATGGCTATCTTTTGATGAGGAAGAAATGTTGTCATGGTATGACAACGAAAAAAATCGAGATGATACATTTGTAACATCTGATAATAAAAAAGGACAATCTCAAAAAACTTGCTTATCAAACATAAGCTTTAAAAATTCAGATGGTTCAAAGCCTACACCTACTAACATAGAAGAATTAGCATCTAATATAGAAAAGAGTAGAAATAAATGTTTATTTAATATTGAACCTGTTCCTGGTTTCGCTGATCTATATGACCCTTATATTAAAATCCCTTATAATTGGCAGTGGAAATCAAATTCTTGGAAAACGCCTGGTCAAGATTGGGCTCCATCAACCCCAAAACCTGATAATGGTGAAGTCATAAATATATTAGCGTATGACAATAATCAGCTTTCAGCAGATACTATTGCAAATAATTCGAAAATTATAACATCAGGTAAGAAAGGTCTAGATTTCATAAAAGTACCATCAGAGAATAATGGTTATTATTTCAGACTAAATAATTACCCTAATTTATTCTTTAGCTATTCAGCTAGTGCAGATGGAACTGTTAAATTAGTAAACTCACCTAAACAATCAGAGTTTATTTTAATAGGAAATAAAAACACATATAACATAAAGAACACATATTGGGATCAGTTCGTATGGTATAATAAAGCTAAAAAATCAGTACATTTAACGTCTCATGGTAACGAAAAAAACACAGACTCGTCATGGACAATATTAAATAAAGATATTAATAACTAG

山東水產學會團體標準《高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法》編制說明《高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法》標準起草工作組2023年7月

《高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法》團體標準編制說明1.項目背景，包括產業現狀、立項背景及必要性等。本標準的提出是根據《中華人民共和國漁業法》、《關于創新體制機制推進農業綠色發展的意見》、《關于加快推進水產養殖業綠色發展的若干意見》、《水產養殖動物疫病防控指南》等國家政策文件對水產養殖綠色發展的要求，積極開發高效、精準并且可以現場應用的病害檢測技術，對于支撐我國水產養殖病害綜合防控技術體系建設和推進水產養殖業綠色高質量發展具有重要意義。美人魚發光桿菌美人魚亞種（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae，PDD）是弧菌科發光桿菌屬美人魚發光桿菌（Photobacteriumdamselae）的一個亞種，廣泛分布于全球海洋環境中，可以感染魚類、甲殼類、軟體動物、海龜、鯨豚類等不同的海洋動物發病，對人也有一定的致病性。PDD首次分離于1971年發生的一起“未知海洋弧菌”感染人類傷口的事件。而后，該菌于1981年再次從患病斑鰭光鰓魚（Chromispunctipinnis）的皮膚潰瘍病灶處被分離出來，被命名為美人魚弧菌（Vibriodamsela），并報道于Science雜志。20世紀90年代，Smith等人將其歸為發光桿菌屬，并重新命名為美人魚發光桿菌美人魚亞種，與魚類巴斯德氏菌病的病原美人魚發光桿菌殺魚亞種（P.damselaesubsp.piscicida）同種。PDD不僅是多種海水養殖動物的病原，還可對人類導致機會性感染。魚類在感染PDD之后的典型特征為局部出血和體表潰瘍性損傷，而人類傷口在感染PDD之后，往往會形成大皰和明顯的水腫，并且有可能發展為壞死性筋膜炎，多器官衰竭。根據現有的文獻報道，PDD主要是因魚刺、魚鉤和水中雜物（如木塊）等扎傷后接觸傷口而感染人。該菌在近海海水環境中廣泛分布，不僅會感染養殖動物發病從而對養殖生產造成經濟損失，還會對海水養殖從業者、海濱浴場游客、海上工程作業人員等構成一些潛在的公共衛生風險，應引起足夠的重視PDD的致病性主要由四種不同的毒素決定，分別是由毒力質粒pPHDD1編碼的damselysin（Dly）和phobalysinP（PhlyP），以及由染色體編碼的phobalysinC(PhlyC)和磷脂酶PlpV。其中Dly由毒力基因dly編碼，是一種對鞘磷脂表現高活性的D-磷脂酶；PlpV由毒力基因plpV編碼，是一種A2-磷脂酶；PhlyP和PhlyC都是穿孔毒素，分別由毒力基因hlyApl和hlyAch編碼，這四種毒素都通過II型分泌系統分泌。穿孔毒素PhlyP與PhlyC之間的加強作用，以及兩種磷脂酶（Dly和PlpV）與兩種穿孔毒素（PhlyP和PhlyC）之間的協同作用可以使菌株對魚類的致病力達到最大。此外，PDD菌株的染色體還能編碼一種膠原酶ColP，這種毒素對菌株的致病性起次要作用。而在諸多致病因子中，攜帶dly基因是決定PDD對魚類致病性強弱的主要毒力基因。到目前為止，我國境內PDD感染海水養殖動物的文獻報道集中于少量的發病案例和病原學報道，該菌被認為是我國海水養殖產業近幾年的新發病原之一。從已有的研究看，PDD可以感染我國從南方至北方的多種海水經濟動物，如鞍帶石斑魚（Epinepheluslanceolatus）、半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）、許氏平鲉（Sebastesschlegeli）、凡納濱對蝦（Penaeusvannamei）等，沒有表現出明顯的地域或宿主特異性。以山東省長島海洋生態文明綜合試驗區周邊海域為例，該海域是我國北方最大的深水網箱養殖區，現有中大型深水網箱738個，海水網箱總養殖水體達到63萬m3。，主養品種為許氏平鲉，年養殖產量在1000噸左右。但近10年來，該地區網箱養殖的許氏平鲉連續在高溫季節暴發流行性的皮膚潰瘍病，該病具有傳播速度快、致死率高等顯著特點，發病期間單口網箱的累計死亡率最高超過了60%（數據來源于長島海洋生態文明綜合試驗區海洋經濟促進中心的調研報告），導致約30%的網箱養殖業主近幾年放棄養殖、空置網箱，經濟損失慘重。本標準起草人在該地區針對該病進行了連續兩年的系統性流行病學調查，不僅充分證實PDD是該病的致病原，也從這一養殖海區不同養殖時期陸續分離獲得了11株PDD菌株。后續的病原學研究結果表明，這11株菌株和本實驗室保存的其他來源的PDD菌株不僅生理生化指標、抗生素藥物敏感性等常規表型指標存在較明顯的差異，與致病力緊密相關的溶血能力也表現了非常明顯的差異。多次人工感染實驗也驗證，這些菌株對許氏平鲉的致病力也存在極為明顯的差異。同為高濃度的活菌液注射感染，致病力強的菌株可以導致實驗魚在極短的時間內就全部死亡，而其他的一些PDD菌株注射后受試魚卻無死亡現象發生。事實上，以生理生化指標和對宿主致病力的強弱作為評判依據，不同PDD菌株在全球范圍內也表現了表型特征多樣化的現象。隨著我國海水養殖產業的轉型升級，深遠海養殖被確認為拓展海水養殖空間的戰略發展方向。目前，山東省已經進行了大型網箱、養殖工船等深遠海養殖模式的先行先試，而許氏平鲉就是深遠海養殖的主要品種之一。參照以往的產業經驗，高密度的養殖模式在發展的過程中往往擺脫不了病害問題的制約。本標準起草人團隊前期的研究已經證實，高致病性PDD是導致網箱養殖許氏平鲉敗血性皮膚潰瘍癥的主要致病原，而海水環境中的PDD菌株存在顯著的致病性差異，部分低致病性的PDD菌株即使感染也不會誘發疾病。因此，建立針對高致病性PDD菌株的檢測技術和標準，實現對不同致病力PDD菌株的差異化檢測，對于深遠海養殖產業中實現對疾病的精準防控是十分有必要的。根據國家標準全文公開系統和中國農業標準網的搜索，僅查找到國家標準《飼料中副溶血性弧菌的檢測》（GB/T26426-2010）、《食品微生物檢驗副溶血性弧菌檢驗》（GB4789.7-2013），未見有關美人魚發光桿菌及其檢測技術標準或規范的報道。制定高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種檢測技術規程，對于指導水產養殖從業者科學規范地進行精準化的病害檢測，降低疾病發生風險，提高疾病防控效率具有指導作用，也為推進我國水產養殖產業的綠色可持續發展提供技術支撐，具有突出的經濟和社會效益。2.工作簡況，包括任務來源、協作單位、主要工作過程、編寫組成員及其所做的主要工作等。（1）任務來源本標準的起草和制訂來源于山東水產學會團體標準制訂項目。（2）協作單位本標準的起草由中國水產科學研究院黃海水產研究所作為牽頭單位，聯合山東信得科技股份有限公司和山東信達基因科技有限公司作為協作單位共同完成。其中，中國水產科學研究院黃海水產研究所負責完成標準的編制以及標準化測試、適用性評價等工作。山東信得科技股份有限公司和山東信達基因科技有限公司，主要負責標準技術參數的驗證和示范。（3）主要工作過程為更好地完成標準的制訂工作，標準起草團隊從以下幾個方面開展了工作：1）標準立項前，團隊成員已進行了相關技術資料的收集。標準立項通知下達后，成立了專門的標準起草小組，制定工作計劃，落實實施方案。2）學習有關政策法規，廣泛收集有關標準和研究成果，包括GB/T1.1-2020《標準化工作導則》、GB/T6682-2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》、GB19489-2008《實驗室生物安全通用要求》、SC/T7014-2006《水生動物檢疫實驗技術規范》、SC/T7201.1-2006《魚類細菌病檢疫技術規程第1部分：通用技術》、SC/T7015-2011《染疫水生動物無害化處理規程》、SN/T2102.1-2008《食源性病原體PCR檢測技術規范第1部分：通用要求和定義》等標準以及國家和農業部有關質量管理規定、產業政策等文件。3）標準編制組收集了國內外相關資料，在國內的海水魚類養殖場、原良種場、網箱養殖企業、深遠海養殖企業進行了系統的流行病學調查，與相關技術人員進行了深入的交流，并充分征求科研、管理等相關部門人員的意見，在總結各方面意見的基礎上確定標準的技術內容，于2023年6月形成標準的征求意見稿和編制說明。4）起草小組于2023年8月份就形成的標準草案征求意見稿及編制說明在全國范圍內公開征求專家意見（征求意見單位及回函單位不少于20家），征求意見的專家單位包括中國海洋大學、江蘇海洋大學、寧波大學、西南大學、海南大學、中國水產科學研究院南海水產研究所、中國水產科學研究院東海水產研究所、山東省海洋科學研究院等，咨詢專家為長期從事水產養殖研究的高級專業技術人員，對標準征求意見稿提出初步的意見和建議，征求意見的時間不少于30天。標準起草小組于10月底收到了全部20為專家的返回意見，并對返回的意見進行匯總和整理，按照專家意見對標準征求意見稿進行修訂，對標準征求意見稿完善后提交秘書處，組織相關專家進行評審。（4）編寫組成員及其所做的主要工作編寫組成員為張正、于永翔、王印庚、羅展、王春元、馬廣斌、趙永偉、張世佳。編寫組成員主要負責標準制訂工作的組織、協調，相關資料的查閱、收集，標準文本及編制說明的起草、撰寫，組織召開研討會，通過現場考察、電子郵件、傳真、電話等方式，征集、整理和歸納相關的意見、標準送審等。所做的主要工作見表1。表1編寫組成員及其所做的主要工作姓名工作單位承擔的工作張正中國水產科學研究院黃海水產研究所主持，方案設計、收集資料、檢驗項目的確認，分析方法設計，標準文本和編制說明的起草于永翔中國水產科學研究院黃海水產研究所協助完成標準技術參數檢測與驗證、征求意見稿與標準編制說明寫作王印庚中國水產科學研究院黃海水產研究所協助完成標準設計，協助完成征求意見稿與標準送審稿編制羅展山東信得科技股份有限公司參與標準編制說明編寫，協助完成標準技術參數驗證王春元中國水產科學研究院黃海水產研究所協助完成標準征求意見稿與編制說明編寫，完成標準專家意見征集與匯總馬廣斌山東信達基因科技有限公司協助完成標準技術參數驗證和應用趙永偉山東信達基因科技有限公司協助完成標準技術參數驗證和應用張世佳山東信得科技股份有限公司協助完成標準技術參數驗證和應用陳偉華中國水產科學研究院黃海水產研究所參與完成了PCR檢測體系和參數的實驗驗證3.標準編制原則和確定標準主要內容（如技術指標、參數、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規則等）的論據（包括試驗、統計數據），修訂標準時，應當列出新、舊標準水平的對比。（1）標準編制原則本標準的提出是根據《關于加快推進水產養殖業綠色發展的若干意見》、《關于創新體制機制推進農業綠色發展的意見》等國家政策文件對水產養殖綠色發展的要求，積極開發高效、精準并且可以現場應用的病原檢測技術并制定技術規程，符合我國有關水產動物病原檢測、疫病診斷的規章及規范性文件要求。標準起草過程中，按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫》給出的規則起草制定，為新制訂標準。標準文本中能直接引用的標準盡量引用，相關內容不再在本標準中出現。（2）確定標準主要內容的論據1）范圍限定了本標準的適用范圍是進行高致病性PDD菌株的PCR檢測。2）規范性引用文件規定了對于本標準的制訂和應用不可缺少的參考標準、規范和其他文件。列舉的引用文件中，凡注日期的文件，僅注日期的版本適用于本標準的參考引用，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于標準的參考引用。3）術語和定義確定了本標準適用的檢測對象為高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種（high-virulentPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae）美人魚發光桿菌美人魚亞種（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae）是弧菌科發光桿菌屬美人魚發光桿菌（Photobacteriumdamselae）的一個亞種，廣泛分布于全球海洋環境中，可以感染魚類、甲殼類、軟體動物、海龜、鯨豚類等不同的海洋動物發病，對人也有致病性。該菌種的不同菌株因攜帶的毒力基因不同，對宿主呈現出高致病性、低致病性和無致病性的致病力表型差異。本標準界定的高致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種是指感染魚類宿主后能引起發病，最短可在數小時內造成宿主死亡，從而引發流行性疾病的菌株。4）PCR引物本標準的技術依據是通過檢測PDD菌株攜帶的不同毒力基因，從而實現對菌株致病力差異性的區分。檢測過程中共使用了兩對PCR引物，包括用于檢測位于菌株染色體上hlyB基因的特異性引物，以及用于檢測位于菌株毒性質粒上dly基因的特異性引物。hlyB基因是一部分致病性細菌溶血素毒力系統中一個重要的毒力基因，位于細菌染色體上，主要表達溶血素轉運蛋白等毒力因子，它并不是像16srDNA基因和gyrB基因等一樣是一個通用型的細菌基因，而是只在一部分細菌中才有，并且其中的部分序列高度保守，具有很好的種間識別性。而dly基因是目前已經確認的只有致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種的高毒力質粒才攜帶的重要毒力基因，主要表達溶血素蛋白。這一基因位于質粒上，會隨著質粒一同丟失，高致病性菌株在丟失這一基因后會變為低致病性或非致病性菌株，所以是作為鑒別美人魚發光桿菌美人魚亞種是否具有高致病力的理想靶標基因。檢測hlyB基因的存在主要確認被檢菌株為PDD，檢測dly基因的存在主要確認被檢的PDD菌株攜帶有高致病性的毒力基因。兩對PCR特異引物序列如下：①hlyB基因的特異引物正向序列hlyB-F:5'-ACTCGCTTACTTGAATCGGAAAT-3'反向序列hlyB-R:5'-TCACGAAAGACATTGAGCATC-3'②dly基因的特異引物正向序列dly-F:5'-TTTGGACGAGCGGTCCATTT-3'反向序列dly-R:5'-GGAGCCCAATCTTGACCAGG-3'5）儀器設備和試劑耗材規定了用于開展高致病性PDD菌株檢測所需的基本條件要求，包括主要的儀器設備，試劑和耗材。6）檢測步驟依據前期的實驗研究和技術驗證結果，確定了開展高致病性PDD菌株PCR檢測的基本實驗步驟，包括三個步驟：①待檢樣品及陰性、陽性對照組的核酸模板制備：詳細描述了對待檢病樣樣品的采集和前處理過程，及相關的技術參數要求，確保最終制備出符合檢測要求的DNA核酸模板。②PCR反應體系的配置：確定了分別用于檢測hlyB基因和dly基因的兩個獨立的PCR反應體系，以及陰性、陽性對照組PCR反應體系的組成。③PCR擴增：確定了進行hlyB基因和dly基因PCR檢測的反應條件參數、產物電泳條件，以及結果觀察方法。7）結果判定主要包括兩部分內容：①檢測結果成立的條件：詳細描述了被檢樣品判定為高致病性PDD感染的條件，即hlyB基因PCR擴增產物電泳檢測后在344bp的位置出現特異性條帶，dly基因PCR擴增產物電泳檢測后在695bp的位置出現特異性條帶，且陰性對照PCR擴增產物電泳后均未出現條帶，則檢測結果成立。②結果判定的方法：對檢測結果可能出現的多種情況及其結果判定進行了詳細說明，分為四種情況：一是在檢測結果成立的前提下，即hlyB基因和dly基因兩條特異性條帶同時出現時，且陰性對照未出現條帶，可判定為高致病性PDD感染。二是在檢測結果不成立的前提下，hlyB基因出現特異性條帶，而dly基因未出現條帶，且陰性對照未出現條帶，可判定為PDD感染，但不是高致病菌株。三是在檢測結果不成立的前提下，只要hlyB基因未出現特異性條帶，無論dly基因是否出現特異性條帶，即可判定該樣品不是PDD感染。四是檢測過程中也可以選擇高致病PDD菌株作為陽性對照。若陽性對照hlyB基因和dly基因任意一個未出現特異性條帶，證明本次檢測存在操作失誤，再次重復該檢測。8）防止交叉污染和廢棄物處理的措施引用了其他已頒布的國標和行標，對檢測過程中防止交叉污染，以及檢測過程中產生的廢棄物和檢測完成后樣品的處理方式進行了規定。4.主要試驗（或驗證）的分析、綜述報告，技術經濟論證，預期的經濟效果。（1）主要試驗（或驗證）的分析本標準起草人在過去的研究中，共收集保存了46株PDD菌株。這些菌株來自國內河北、天津、山東、江蘇、浙江、福建、海南7個省市，分離自大菱鲆、褐牙鲆、半滑舌鰨、許氏平鲉、大瀧六線魚、褐點石斑魚、珍珠龍膽石斑魚、赤點石斑魚、大黃魚、南美白對蝦、高鰭鯊、皺紋盤鮑等12個海水養殖品種，時間跨度長達11年，基本上覆蓋了我國的主要海水養殖區域。在對這些菌株的持續研究中，發現不同的PDD菌株在生理生化指標、抗生素藥物敏感性、溶血和磷脂酶表型，以及對魚類宿主的致病力方面都存在著極為明顯的差異。因此，開展不同致病力菌株的差異化檢測，對在生產中高效、精準的預防PDD感染就尤為重要。通過對高致病力、低致病力和無致病力的PDD菌株進行全基因組的比較分析，發現其致病力的差異主要是由于攜帶不同的毒力基因而導致的。通過深入的基因組解析，并檢索了大量文獻，最終選定位于染色體上的hlyB基因和位于毒性質粒上的dly基因作為檢測高致病性PDD菌株的鑒別基因。其中，位于染色體上的hlyB基因是所有PDD菌株都攜帶的毒力系統基因之一，其基因序列相對保守，主要用于鑒別被檢菌株為PDD菌株。而dly基因是高致病性PDD菌株毒性質粒攜帶的特有毒力基因，只有攜帶該基因的PDD菌株才會表現出極強的致病力，也是鑒別高致病性PDD菌株的標志性基因。由于該基因位于菌株的質粒上，因此存在質粒自然轉移的風險，有可能會將dly基因轉入其他非PDD菌株。因此，本標準的技術思路是通過對hlyB基因和dly基因同步檢測的方式，來實現對高致病性PDD菌株的快速檢測鑒別。（2）綜述報告確定上述技術思路后，本標準起草人團隊對hlyB基因和dly基因進行了全序列分析，并挑選了其中高度保守的一段序列，設計了特異性引物，并委托相關公司進行了引物合成。隨后，從實驗室的菌種庫中挑選出23株不同的細菌菌株（表1）進行了hlyB基因引物特異性的檢測，實驗結果顯示只有3株PDD菌株在344bp的位置出現條帶，其余的20株非PDD菌株均未出現條帶，證明所設計的hlyB基因對PDD菌株具有較好的特異性，可以用于對PDD菌株的特異性檢測。表1用于驗證hlyB基因引物特異性的菌株序號菌株拉丁名編號來源1美人魚發光桿菌美人魚亞種Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1605實驗室分離2美人魚發光桿菌美人魚亞種Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1608實驗室分離3美人魚發光桿菌美人魚亞種Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1808實驗室分離4輪蟲弧菌vibriorotiferianusVR1實驗室分離5輪蟲弧菌vibriorotiferianusVR2實驗室分離6輪蟲弧菌vibriorotiferianusVR3實驗室分離7哈維氏弧菌VibroharveyiVHBZ0001購自北微所8哈維氏弧菌VibroharveyiVHBZ0002實驗室分離9哈維氏弧菌VibroharveyiVHBZ0003實驗室分離10鰻弧菌VibrioanguillarumVABZ0001購自北微所11鰻弧菌VibrioanguillarumVABZ0002實驗室分離12燦爛弧菌VibriosplendidusVSBZ0001購自北微所13燦爛弧菌VibriosplendidusVSBZ0002實驗室分離14副溶血弧菌VibrioparahaemolyticusVPBZ0001購自北微所15副溶血弧菌VibrioparahaemolyticusVPBZ0002實驗室分離16溶藻弧菌VibrioalginolyticusVABZ0003購自北微所17溶藻弧菌VibrioalginolyticusVABZ0004實驗室分離18費氏弧菌VibriofischeriSm02112702A購自北微所19大菱鲆弧菌VibrioscophtalmiVS1實驗室分離20嗜環弧菌VibriocyclitrophicusVC1實驗室分離21大腸桿菌EscherichiaColiTrans1-T1實驗室分離22大腸桿菌EscherichiaColiTrans1-T2實驗室分離23大腸桿菌EscherichiaColiTrans1-T3實驗室分離完成了對hlyB基因引物特異性的驗證后，本標準起草人團隊又從實驗室的菌種庫中挑選出25株不同來源的PDD菌株，其中包括已經完成全基因組解析和致病力驗證的2株高致病性菌株，分別用設計的hlyB基因引物和dly基因引物對這25株PDD開展了特異性檢測，結果如圖1和圖2所示，25株PDD菌株的hlyB基因引物全部出現了特異性條帶，而只有其中的2株高致病性菌株的dly基因引物出現了特異性條帶，證實本標準的技術思路可以實現對高致病性PDD菌株的精準檢測。圖1用hlyB基因引物對25株PDD菌株的PCR檢測結果圖2用dly基因引物對25株PDD菌株的PCR檢測結果（3）技術經濟論證本標準面向海水養殖產業中病害防控的痛點問題，規定了高致病性PDD菌株的PCR檢測方法，適用于魚類、對蝦等主要養殖品種對PDD感染檢測的技術需求。采用本標準進行檢測，能夠準確鑒別出具有高致病性的PDD菌株，實現對PDD感染的精準防控。標準的制訂，對養殖產業中的病害臨床防控具有重要的指導意義，能夠有效節約養殖生產單位在防控PDD疾病感染過程中的人力和物力投入。（4）預期的經濟效益2019年，農業農村部聯合十部委共同印發了《關于加快推進水產養殖業綠色發展的意見》，其中第十五條“加強疫病防控”中提出了應“提高重大疫病防控和應急處置能力”。2022年，山東省委、省政府印發了《海洋強省建設行動計劃》，其中再次強調了要發展深遠海養殖，推進近海漁業向深遠海發展。PDD是本標準起草人團隊在近十年的流行病調查中發現的感染許氏平鲉、大黃魚等深遠海養殖魚類的新興病原菌，可引起嚴重的疾病和導致極高的死亡率。但不同PDD菌株的致病力存在顯著的差異性，部分無致病力PDD菌株即使感染魚類宿主也不會導致疾病和死亡。因此，在養殖生產中精準的檢測高致病性PDD菌株就能夠顯著提高疾病防控的有效性。本標準制訂實施后，對養殖企業預期的經濟效益體現在兩方面，一是建立的PDD檢測方法可以為生產中提供技術規范，通過對病原的檢測并提前采取措施實現對疾病的有效預防，從而顯著降低疾病的發生風險，減少病害損失。二是通過對不同致病力PDD菌株的精準檢測，使對病原感染的防控更有針對性，更加精準化，可以避免一些不必要的投入品（如藥物）的使用，為企業節約養殖成本，同時也有利于保護養殖水域的生態環境，創造較好的生態效益。5.標準涉及的相關知識產權說明。通過文獻檢索，與本標準內容直接相關的知識產權有：①國家發明專利，強致病性和非強致病性美人魚發光桿菌美人魚亞種的快速鑒定PCR反應體系，專利號ZL201911178338.5，授權日期2020年7月3日。②國家發明專利，適用于美人魚發光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應體系，專利號ZL202010558367.0，授權日期2021年8月10日。③上海海洋大學碩士學位論文，不同美人魚發光桿菌美人魚亞種菌株對許氏平鲉致病力差異分析，論文作者施琳妮，論文提交時間2019年。④上海海洋大學碩士學位論文，兩種海水魚類致病菌現場快速檢測技術的建立與應用，論文作者陳京，論文提交時間2020年。上述知識產權全部為本標準起草人團隊完成并獲得，不存在知識產權糾紛的情況。6.采用國際標準和國外先進標準的程度，以及與國際、國外同類標準水平的對比情況，或與測試的國外樣品有關數據的對比情況。通過對國家標準全文公開系統（/bzgk/gb/）、中國農業標準網（/）和中國知網（）等標準檢索網站的搜索查詢，未檢索到美人魚發光桿菌美人魚亞種檢測相關的國內外標準，僅檢索到《飼料中副溶血性弧菌的檢測》（GB/T26426-2010）、《食品微生物檢驗副溶血性弧菌檢驗》（GB4789.7-2013）等內容相近但適用對象不同的標準。因此，本標準屬于新制訂的標準。本標準在編制過程中，查閱和參考了美人魚發光桿菌美人魚亞種致病機理等方面的最新文獻資料，同時引用了SC/T7014-2006、SC/T201.1-2006、SC/T7015-2011、SN/T2102.1-2008等有關水生動物病原檢疫、染病動物無害化處理等方面的行業標準，并結合了美人魚發光桿菌美人魚亞種在我國海水養殖產業中的流行情況和致病特點，制訂了本標準，以使本標準的技術內容更加科學、完善，為在養殖生產中高效的開展病原檢測提供技術依據。7.與現有相關法律法規及相關標準的協調性。本標準符合《中華人民共和國漁業法》和《中華人民共和國動物防疫法》的規定；符合農業農村部印發的《農業綠色發展技術導則（2018-2030年）》和《加快推進水產養殖業綠色發展的若干意見》的相關要求；符合農業農村部漁業漁政管理局印發的《水產養殖動物疾病防控指南（試行）》中“養殖場應定期開展水產養殖動物疾病監測和檢測”的指導原則。本標準內容與現行的各項法律法規、強制性標準及各部委規章相協調，均無沖突。8.重大意見分歧的處理經過和依據。本標準的制訂立項、內容審定和頒布實施都將履行專家評審制度，廣泛征求來自研究、生產、檢測、管理等單位的專家意見。截止目前，專家們對標準內容細節提出了很多修改和完善的建議，但并未對標準的立項和制訂提出重大的分歧性意見。如果在后續的審定過程中出現重大分歧意見，將根據具體的意見內容，按照標準審定程序，征集更多的專家意見，并按照少數服從多數的原則，與意見分歧專家進行當面溝通并協商解決。9.貫徹標準的要求和措施建議（包括組織措施、技術措施、過渡辦法等內容）。本標準的發布，將為海水養殖生產中精準的檢測PDD感染建立有章可循的技術標準，從而指導養殖企業進行科學防控，降低疾病發生風險，保障漁業環境安全和養成水產品的質量安全。標準起草人團隊將認真做好標準文本的制訂、修改和送交評審等各項工作，同時在評審的過程中加強與評審專家、養殖企業、主管部門等的聯系溝通，利用各種渠道做好制訂本標準的目的、意義、精神、技術內容方面的宣貫工作，宣傳標準化工作的重要性。同時，團隊成員將結合自身的科研工作，加強對不同海水養殖系統內高致病性PDD菌株的監測力度，定期對多種養殖生境下水產動物病原攜帶情況進行跟蹤檢測，對高致病性PDD菌株的留存狀況和致病風險進行排查，從而推動本標準內容在養殖企業中得以有效的實施，降低高致病性PDD菌株感染海水養殖動物發病的概率，減少因病損失。此外，鼓勵不同的科研單位和養殖生產企業結合科研生產的實際情況，針對本標準技術進行優化和升級，為今后修訂本標準做好技術儲備。10.其他應予說明的事項。無。主要參考文獻劉瀟,張正,王麗芳,等.海南地區與環渤海灣美人魚發光桿菌美人魚亞種水產動物分離株的表型與遺傳特征分析[J].微生物學報,2021,61(07):2101-2111.FouzB,LarsenJL,NielsenBB,etal.CharacterizationofVibriodamselastrainsisolatedfromturbotScophthalmusmaximusinSpain[J].DiseasesofAquaticOrganisms,1992,12(3):155-166.TakahashiH,MiyaS,KimuraB,etal.DifferenceofgenotypicandphenotypiccharacteristicsandpathogenicitypotentialofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaebetweenclinicalandenvironmentalisolatesfromJapan[J].MicrobialPathogenesis,2008,45(2):150-158.RivasAJ,LemosML,OsorioCR.Photobacteriumdamselaesubsp.damselae,abacteriumpathogenicformarineanimalsandhumans[J].FrontiersinMicrobiology,2013,4.KregerAS.CytolyticactivityandvirulenceofVibriodamsela[J].InfectImmun,1984,44(2):326-331.BaladoM,PuentesB,CouceiroL,etal.SecretedcitrateservesasironcarrierforthemarinepathogenPhotobacteriumdamselaesubspdamselae[J].FrontiersinCellularandInfectionMicrobiology,2017,7:361.PuentesB,BaladoM,Bermúdez-CrespoJ,etal.AproteomicanalysisoftheironresponseofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaerevealsmetabolicadaptationstoironlevelschangesandnovelpotentialvirulencefactors[J].VeterinaryMicrobiology,2017,201:257-264.LoveM,Teebken-fisherD,HoseJE,FarmerJJ,HickmanFW,FanningGR.1981.Vibriodamsela,aMarineBacterium,CausesSkinUlcersontheDamselfishChromispunctipinnis.Science,214:1139–1140.KettererP,EavesL.1992.Deathsincaptiveeels(Anguilareinhardtii)duetoPhotobacterium(Vibrio)damsela.AustralianVeterinaryJournal,69:203–204.LabellaA,VidaM,AlonsoMC,InfanteC,CardenasS,Lopez-RomaldeS,ManchadoM,BorregoJJ.2006.FirstisolationofPhotobacteriumdamselaessp.damselaefromculturedredbandedseabream,PagrusaurigaValenciennes,inSpain.JournalofFishDiseases,29:175–179.VaseeharanB,SundararajS,MuruganT,ChenJC.2007.Photobacteriumdamselaessp.damselaeassociatedwithdiseasedblacktigershrimpPenaeusmonodonFabriciusinIndia.LettersinAppliedMicrobiology,45:82–86.SongY-L,ChengW,WangC-H.1993.IsolationandcharacterizationofVibriodamselaInfectiousforculturedshrimpinTaiwan.JournalofInvertebratePathology,61:24–31.A.Lozano-León,C.R.Osorio,S.Nu?ez,J.Martínez-UrtazaBM.2003.OccurrenceofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaeinbivavlvemolluscsfromNorthwestSpain.EuropeanAssociationofFishPathologists,23(1):40–44.ObendorfDL,CarsonJ,McManusTJ.1987.VibriodamselaInfectioninaStrandedLeatherbackTurtle(Dermochelyscoriacea).JournalofWildlifeDiseases,23(4):666–668.FujiokaRS,GrecoSB,CatesMB,SchroederJP.1988.VibriodamselafromwoundsinbottlenosedolphinsTursiopstruncatus.Diseasesofaquaticorganisms,4(1):1–8.LeeK,KimHK,SohnH,ChoY,ChoiY-M,JeongDG,KimJH.2018.GenomicinsightsintoPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaestrainKC-Na-1,isolatedfromthefinlessporpoise(Neophocaenaasiaeorientalis).MarineGenomics,37:26–30.GoodellKH,JordanMR,GrahamR,CassidyC,NasrawaySA.2004.RapidlyadvancingnecrotizingfasciitiscausedbyPhotobacterium(Vibrio)damsela:Ahyperaggressivevariant.CriticalCareMedicine,32:278–281.張曉君,秦國民,陳翠珍,房海,閻斌倫.2009.龍膽石斑魚源美人魚發光桿菌的生物學特性與系統發育學分析.漁業科學進展30:38–43.YanN,ZhangZQ,WuTL,ZhuJX,FuYF,HanHS,WangHB,ShiQM,GaoGS.2018.IsolationandidentificationofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae(PDD)fromTongueSole.AnimalHusbandryandFeedScience,10(2):99–102.ZhangZ,YuY,WangK,WangY,JiangY,LiaoM,RongX.2019.FirstreportofskinulcerationcausedbyPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaeinnet-cageculturedblackrockfish(Sebastesschlegeli).Aquaculture503:1–7.WangZY,ShiCY,WangHL,WanXY,ZhangQL,SongXL,LiG,GongM,YeSG,XieGS,HuangJ.2020.AnovelresearchonisolationandcharacterizationofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaefromPacificwhiteshrimp,Penaeusvannamei,displayingblackgilldiseaseculturedinChina.Journaloffishdiseases,43(5):551-559.施琳妮,于永翔,姜勇,張正,王印庚,廖梅杰,榮小軍.2019.不同來源美人魚發光桿菌美人魚亞種菌株表型差異性分析.海洋科學43:15–24.TercetiMS,VencesA,MatanzaXM,DalsgaardI,PedersenK,OsorioCR.2018.MolecularepidemiologyofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaeoutbreaksinmarinerainbowtroutfarmsrevealsextensivehorizontalgenetransferandhighgeneticdiversity.Frontiers