T/CVMA170—2024口蹄疫病毒O型磁微粒化學發(fā)光抗體檢測MagneticparticlechemiluminescentimmunoassaydetectionofantibodiesagainstfootandmouthdiseasevirustypeO2024-7-4發(fā)布2024-7-4實施中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I本文件由洛陽現(xiàn)代生物技術研究院有限公司技有限公司、華南農業(yè)大學、河南科技大學、中山市動物1本文件適用于豬、牛、羊等動物血清中口蹄疫病毒O型抗體的檢測2規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范CLIA：化學發(fā)光免疫分析（ChemiluminescenceimmunoFMDV-O：口蹄疫病毒O型（FootandMouthDiseaseVirusTypeO）RLU：相對光單位發(fā)光值（RelativeLightUnit）carbodiimidehydrochlori2本文件采用磁微粒化學發(fā)光——競爭法原理，用口蹄疫病毒O型VP1重組蛋白包被磁微粒，酶標單克隆抗體與待檢樣品中的抗體競爭性的與包被抗原結合，通過抗原抗體反應，形成抗原-酶標抗體復合物、抗原-待測抗體復合物；抗原-酶標抗體復合物催化發(fā)光底物液發(fā)出光子形成發(fā)光值（RLU其發(fā)毒O型抗體水平，比值越大，說明樣本中口蹄疫病毒O型抗體水平越低；比值越小，說明樣本中口蹄疫6.1包被磁微粒混懸液，按照附錄A制按照NY/T541中規(guī)定進行樣本的采集與處理，期間做好個人防護。按常規(guī)方法抽取2mL～3按照NY/T541中規(guī)定進行血清樣本的存放與運輸。血清樣本若在一周內檢測，置2℃~8℃條件下保存。若超過一周檢測，置于-20℃以下冷凍保存。運將待檢樣品從2℃~8℃或-20℃冰箱取出，靜置至室溫。3參照磁微粒化學發(fā)光儀器系統(tǒng)操作說明，設置儀器參數(shù)，將分裝有1×洗滌液、酶結合物、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液的試劑瓶分別插入儀器相應孔。開機自檢，待儀器自檢、管路清洗1次、底物灌注b）加磁微粒混懸液。每孔分別加入磁微粒混懸液20μL。9試驗成立條件S/N=待測樣本發(fā)光值/陰性對照孔平均發(fā)光值。S/N≤0.8為口蹄疫病毒O型抗體陽性；S/N＞0.8，為口4取1mL磁微粒原液進行磁分離至上清澄清，棄去上清；移液器移取1mL加入1mL4mg/mLEDC活化劑溶液，蓋緊瓶蓋/容器封口，室溫條件下?lián)u床溫育反應60min。A.2洗滌將反應容器進行磁分離至上清澄清，棄去上清；移液器移取4mL包被緩沖液加入反應容器內，以A.3包被先加入10mL包被緩沖液，將反應容器內的磁微粒以100r/min攪拌5min，口蹄疫病毒O型VP1重組蛋白。蓋緊瓶蓋/容器封口，2℃~8℃條件下?lián)u床反應120min。A.4封閉將反應容器進行磁分離至上清澄清，棄去上清；移液器移取4mL磁微粒洗滌液加入反應容器內；應容器內；以100r/min混合15min，最終進行磁分離至上清澄清，棄去上清。A.5儲存量取磁微粒保存液100mL加入反應容器內，以100r/m5脂紅色素，攪拌均勻，經0.22μm濾膜過濾除菌，無菌定量分裝，置2℃~8℃保存。稱取24.23gTris（三羥甲基氨基甲烷）溶于80稱取15.42g乙酸銨溶于800mL純水中，使用乙酸調p60.22μm濾膜過濾除菌后，按血清量的0.1%加入Proclin300對照，置2℃~8℃保存?zhèn)溆谩Ｐ浴ｎi靜脈采血，分離血清，經56℃水浴滅活30min后，按血清量的0.1%加入Proclin3