第54講

基因工程的基本工具和基本操作程序1.基因工程的概念？操作水平？原理？優點？2.DNA重組技術的三種工具及其作用？3.DNA粗提取的原理？DNA鑒定的原理？4.基因工程的四個步驟？導入的方法有哪些？檢測與鑒定的方法？5.PCR的全稱、原理、條件、過程？如何用電泳鑒定PCR結果？第53講胚胎工程回歸課本：第3章第1、2節P67-86第55講基因工程的應用和蛋白質工程回歸課本：第3章第3、4節P87-98核心知識：目的基因基因重組受體分子遺傳性狀基因工程的概念P67基因工程得以實現的理論基礎是？拓展基因工程的理論基礎蘇云金桿菌與載體拼接普通棉花（無抗蟲特性）棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因導入Bt基因重組DNA分子基因工程的實現需要解決哪些問題？1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構建3.將目的基因導入受體細胞4.目的基因的

檢測與鑒定如何篩選和獲取目的基因？需要什么工具？為何要拼接？如何拼接？需要什么工具？將目的基因導入不同生物細胞的方法基因表達載體在結構上需具備哪些條件？P80目的基因一定能進入受體細胞嗎？進入受體細胞后一定能表達嗎？工具工具酶分子運輸車：

。（１）

。（２）

。ＤＮＡ連接酶載體【注意】工具≠工具酶質粒噬菌體動植物病毒“手術刀”“縫合針”一、重組DNA技術的基本工具限制性內切核酸酶，簡稱限制酶1.限制酶原核生物數千特定核苷酸序列磷酸二酯鍵黏性末端一、重組DNA技術的基本工具1、原核生物中存在限制酶的意義是什么？P71“旁欄思考”：原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。2、限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。基礎過手3、突破：用限制酶切割時需注意的事項——①獲取一個目的基因需限制酶切割

次,共產生

個游離的磷酸基團②獲取目的基因和切割載體時,通常使用同種限制酶,目的是

。但是使用該法缺點是容易發生

，為了避免上述情況發生，可采取的措施是

。為了產生相同的黏性末端，便于連接兩4使用兩種不同的限制酶同時去切割目的基因和載體目的基因、質粒的自身環化以及目的基因與質粒反向連接基礎過手限制酶如何選擇呢？“限制酶”的選擇例1.①用圖1中的質粒和圖2中的外源DNA構建重組質粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。SmaⅠ會破壞質粒中的抗性基因以及破壞目的基因“限制酶”的選擇例2.如圖是培育表達人乳鐵蛋白的乳腺生物反應器的技術路線用圖2中的人乳鐵蛋白目的基因和圖1所示的質粒構建重組質粒時，選用的限制酶是

（從“EcoRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中選擇）．不能選擇其他限制酶的理由分別是：

。BamHⅠ/HindⅢ若選EcoRⅠ會破壞質粒的復制原點，單酶切還會導致目的基因、載體的自身環化，以及反向連接若選SmaⅠ/HindⅢ，則構建的重組質粒沒有標記基因或復制原點②不能破壞目的基因序列；①不能破壞啟動子、終止子、抗性基因、復制原點等特殊序列；小結：“限制酶”的選擇③為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接，可采用雙酶切；④確保出現相同黏性末端原則：無同源酶時可替代選擇同尾酶（識別序列完全一致，但能產生相同的黏性末端）2.DNA連接酶P72磷酸二酯鍵大腸桿菌黏性末端黏性末端分子縫合針一、重組DNA技術的基本工具只是連接平末端的效率相對較低小結：DNA連接酶與DNA聚合酶的比較：相同點——都是催化形成磷酸二酯鍵不同點——DNA聚合酶DNA連接酶DNA連接酶DNA聚合酶：將單個核苷酸連接到DNA片段上DNA連接酶：DNA片段與DNA片段噬菌體有一個至多個自我復制受體DNA標記☆☆最常用的載體——質粒，它是裸露的（表面無蛋白質）、可存在于真核細胞核以外或原核擬核之外，并有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。3.載體經人工改造1.在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。根據下圖示判斷下列操作錯誤的是()A.質粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B.用限制酶切割獲得目的基因時，有四個磷酸二酯鍵被水解C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后獲得的黏性末端相同D.質粒中標記基因便于篩選出目的基因已經表達的細胞D基礎過手做題技巧：選項看完，D明顯錯，是篩選含有目的基因的細胞都產生GATC——若用酶II則質粒的兩個標記基因都被破壞若用酶I則目的基因只能切開左端2.某線性DNA分子含有3000個堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的產物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的識別序列和切割位點如圖所示。下列有關說法正確的是()a酶切割產物(bp)b酶再次切割產物(bp)1600；1100；300800；300A.在該DNA分子中，a酶與b酶的識別序列分別有3個和2個B.a酶與b酶切出的黏性末端不能相互連接C.a酶與b酶切斷的化學鍵不相同D.用這兩種酶和DNA連接酶對該DNA分子進行反復切割、連接操作，若干循環后，D序列會明顯增多a、b酶識別序列不同，但切出的黏性末端相同——叫同尾酶，可以相互連接，B錯；C也明顯a酶將線狀DNA切成3段，說明有2個識別序列b酶將1600切成800+800，將1100切成800+300，說明有2個識別序列2.實驗原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精。（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色。00.14NaCI濃度（mol/L）DNA溶解度1.實驗設計思路：DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當的物理或化學方法去除其他成分，對DNA進行提取。二、DNA的粗提取與鑒定P74DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。3.選材：4.試劑：①研磨液②體積分數為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——含有NaCl、SDS和HCl——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現配現用二、DNA的粗提取與鑒定P74冷酒精析出DNADNA的鑒定（沸水浴、二苯胺）研磨稱取約30g洋蔥切碎，放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。紗布過濾取上清液在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可將研磨液直接離心在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數為95%)，靜置2～3min，溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；取兩支試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物溶于其中一試管NaCl溶液中。然后，另一試管為空白對照，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。二、DNA的粗提取與鑒定P74①以血液為實驗材料時，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。②利用動物細胞提取DNA破碎細胞的方法：動物細胞無細胞壁，可直接吸水漲破。③加入研磨液后，必須充分研磨，否則細胞核不會充分破碎，釋放出的DNA量就會減少。④加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。⑤預冷的酒精具有以下優點：a.可抑制DNA酶的活性，進而抑制DNA降解；b.抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；c.低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。注意事項二、DNA的粗提取與鑒定P741、篩選合適的目的基因的方法有——

①從相關的已知結構與功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。②利用序列數據庫（GenBank）和序列比對工具(BLAST)進行篩選。第一步

目的基因的篩選與獲取明確目的基因后，怎么獲取它呢？可以人工合成目的基因，比如逆轉錄法——思考：通過逆轉錄法得到的cDNA片段相比于直接從真核細胞中酶切獲得的目的基因片段，在基因結構上有何區別？真核生物的目的基因本身包含內含子,而由成熟mRNA逆轉錄合成的目的基因片段只含外顯子，無內含子。這會有什么好處呢？1、篩選合適的目的基因第一步

目的基因的篩選與獲取在真核生物中，轉錄后的原始mRNA（pre-mRNA）需要經過剪接，將基因的內含子對應轉錄出的序列切除，將外顯子對應轉錄出的序列連接起來，形成成熟的mRNA，才能進而翻譯出蛋白質。原核生物沒有真核細胞特有的mRNA剪接加工機制，因此如果直接將酶切獲得的真核生物的基因本身導入原核生物，導致無法加工形成成熟mRNA，無法正確表達。而使用逆轉錄合成出的cDNA不含有內含子，就可以直接導入到原核細胞內，并在原核生物中正確表達。2、利用PCR獲取和擴增目的基因科學家人工合成了目的基因，常用PCR特異性地快速擴增目的基因逆轉錄法人工合成胰島素基因？快速獲得大量胰島素基因2、利用PCR獲取和擴增目的基因結合體內DNA復制過程，思考PCR的進行需要哪些條件？PCR——聚合酶鏈式反應PCR是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸(實際加入的一般是4種dNTP，水解2個磷酸后獲得脫氧核苷酸)激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶條件P77☆引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸2、利用PCR獲取和擴增目的基因問題：設計目的基因的引物時，需要考慮哪些方面的因素呢？②在引物的5’端上游加入適當的限制性酶識別序列（便于和被同種限制酶切割后的載體相結合）第一步

目的基因的篩選與獲取①目的基因的3’端序列（因為DNA聚合酶不能從頭合成DNA）DNA模板①變性：加熱至90℃以上使雙鏈解聚為單鏈②復性:冷卻至50℃左右，2種引物與DNA結合引物③延伸:上升到72℃，DNA合成+耐高溫的DNA聚合酶+dATP+dGTP+dCTP+dTTP第一輪的產物,又可作為下一個循環模板①變性90℃以上②復性③延伸冷卻加熱50℃左右引物模板結合72℃左右DNA從5’端到3’端延伸。72℃時，2、利用PCR獲取和擴增目的基因過程易錯提醒PCR擴增過程中的循環圖示與規律①1個模板DNA分子經過n輪PCR，可以擴增出

個DNA片段，共需要引物數量為

。②1個模板DNA分子經過

輪PCR，可以擴增出僅含目的基因的片段，定量規律：

。

2n2n＋132n-2n－2(2020·北京)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中(如圖)。為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴增時，應選擇的引物組合是A.①＋③ B.①＋②C.③＋② D.③＋④B高考練兵需要檢測高效啟動子是否和HMA3基因連接著導入了楊樹細胞(1)基因表達載體的目的①使目的基因在受體細胞中穩定存在，且可以遺傳給下一代；②使目的基因能夠在受體細胞中表達和發揮作用。(2)基因表達載體的組成位置：功能：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質。目的基因的上游（一段有特殊結構的DNA片段，緊挨轉錄起始位點）人們所需要的基因位置：功能：基因的下游3’端（一段特殊的DNA片斷）終止mRNA的轉錄如抗性基因，用來鑒別或篩選含有重組DNA分子的細胞第二步基因表達載體的構建還可人工構建誘導型啟動子，當誘導物存在時可激活或抑制基因表達(3)基因表達載體的構建過程基因表達載體構建模式圖第二步基因表達載體的構建單酶切缺點?A.目的基因自身環化B.質粒重新環化C.質粒與目的基因反向連接通過雙酶切法解決這些問題將目的基因導入受體細胞的方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法我國科學家獨創,培育出了抗蟲棉第三步將目的基因導入受體細胞(1)花粉管通道法②在植物授粉后一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；第三步將目的基因導入受體細胞(植物)(2)農桿菌轉化法示意圖Ti質粒目的基因構建基因表達載體含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌導入植物細胞目的基因插入植物染色體DNA中植物細胞表現出新性狀的植株植物組織培養將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA中，通過農桿菌的轉化作用，使目的基因進入植物細胞轉化：指目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程。操作程序：取受精卵顯微注射胚胎移植為什么常選用受精卵作為受體細胞呢？提純基因表達載體①體積大，易操作。②全能性高，易培養成完整個體。第三步將目的基因導入受體細胞(動物)——顯微注射法方法——使用Ca2+處理：可使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。P82過程Ca2+處理細胞感受態細胞基因表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA分子大腸桿菌細胞注意：原核生物沒有內質網、高爾基體，它作為受體細胞產生出的真核生物蛋白質通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。第3步將目的基因導入受體細胞(微生物)微生物作為受體細胞的優點：繁殖快，單細胞，遺傳物質相對較少，易于培養操作類型步驟檢測內容方法分子檢測第一步轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因PCR等技術第二步目的基因是否轉錄出mRNAPCR等技術第三步目的基因是否翻譯形成蛋白質抗原-抗體雜交技術個體水平鑒定抗蟲或抗病的接種實驗抗性以及抗性程度

抗性檢測；基因工程產品與天然產品的功能活性比較

功能活性。第四步目的基因的檢測與鑒定加入相應的抗體1、紫花苜蓿是一種重要的牧草。某研究團隊擬將耐鹽基因HAL1導入紫花苜蓿中培育耐鹽牧草。具體實驗流程如圖所示。下列操作錯誤的是

(

)A．可選用氯化鈣處理農桿菌，有利于重組Ti質粒導入農桿菌B．將農桿菌與苜蓿愈傷組織一起培養一段時間后，往往需要添加適量抗生素抑制農桿菌生長C．為確認轉基因苜蓿是否培育成功，需對苜蓿植株進行耐鹽檢測D．耐鹽基因應插入T-DNA片段以外，防止破壞T-DNAD基礎過手2.戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結構蛋白(pORF2)位于病毒表面，構成病毒的衣殼。我國科研人員利用基因工程技術，在大腸桿菌中表達pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關于該疫苗的敘述，正確的是A.過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是

A、U、G、CB.重組基因表達載體上的啟動子需來源于戊型肝炎病毒C.過程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環境中

DNA分子的生理狀態D.過程⑥大量制備pORF2蛋白前應做相應的檢測與鑒定D基礎過手①是逆轉錄過程大腸桿菌細胞聯想：PEG有什么作用？篩選出能成功表達目的蛋白的大腸桿菌，再進行培養1.DNA體外擴增的原理PCR利用了DNA熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，實現體外擴增。PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器，一次PCR一般要經歷30次循環。PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。2.DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。四、DNA片段的擴增及電泳鑒定P84-85循環程序變性復性延伸預變性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。（緩沖液、脫氧核苷酸、2種引物、Taq酶、模板DNA）待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。移液離心擴增3.PCR實驗操作步驟注意：預變性和最后一次循環時加熱變性時間更長根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。凝膠溶液完全凝固后小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物（Marker）。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳、觀察接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。4.DNA的電泳鑒定1．下列有關“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是()

A．新鮮豬血、菜花等動植物材料均可用于DNA的粗提取

B．植物材料需先研磨破碎細胞

C．DNA只能溶于2mol/L的NaCl溶液

D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑后，顏色呈紫色B2．下列關于PCR操作過程的敘述，錯誤的是()

A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前須進行高壓滅菌

B．PCR利用了DNA的熱變性原理

C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化

D．在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換CP85注意事項：緩慢融化—避免破壞緩沖液中穩定性較差的成分，同時保護酶的活性基礎過手乳腺（房）生物反應器器官移植生長五、基因工程的應用P87-92（1）乳房（乳腺）生物反應器：

①具體做法：將

基因與

等調控組件重組在一起，通過

方法，導