?人體微生態常見研究思路及案例詳解解螺旋

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知識金牌解

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牌01常見研究思路及案例詳解02人體微生態整體研究路線CONTENTS課

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錄人體微生態整體研究路線01解

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牌表型干預時間群體選擇糞便腸黏膜……樣本選取16S宏基因組宏轉錄組代謝組……檢測物種數據 ?基因分析 ?功能代謝臨床指標多組學動物實驗驗證結果驗證人體微生態研究整體路線解

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牌人體微生態研究方法DOI:10.3389/fped.2017.00138代謝產物基因表達水平群落組成基因及基因功能宏基因組學宏轉錄組學宏蛋白組學宏代謝組學DNARNA蛋白質代謝產物蛋白水平微生物多樣性宏基因組測序宏轉錄組測序蛋白質檢測代謝產物檢測人體特定部位研究對象組學技術研究方法產出解

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牌DOI:

10.1021/acsnano.5b07826不同組學技術能夠得到的信息解

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牌微生物實驗設計需要考慮的因素Doi:10.1038/s41579-018-0029-9解

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牌重復性選擇性一致性關聯性多個體，多位點，大樣本量，以排除個體之間的差異遺傳背景、生活飲食習慣、生長

環境、性別年齡、取樣方法、提取方法一致排除有嚴重病史、使用抗生素、有藥物依賴等個體采集與研究疾病相關的生理生化指標，研究致病性原因取樣策略總結入選標準：有糖尿病的漢族人（年齡：>50歲；6.5%

≤

糖化血紅蛋白HbA1c

≤

12.0%

。）；排除標準：I

型糖尿病；嚴重的糖尿病并發癥（糖尿病視網膜病變、糖尿病神經病變、糖尿病腎病和糖尿病足）；嚴重肝病(包括慢性持續性肝炎、肝硬化或乙肝病毒表面抗原陽性或肝轉氨酶異常(血清丙氨酸轉氨酶或天冬氨酸轉氨酶>2.5×上限)；報名前3個月內連續使用抗生素>3天，連續使用減肥藥>1個月，8周內服用過益生菌；胃腸手術(闌尾炎或疝手術除外)；在招募前6個月內患有嚴重精神疾??；接受藥物治療以治療膽囊炎、消化性潰瘍、

尿路感染、急性腎盂腎炎、尿囊炎或甲狀腺機能亢進；垂體功能障礙；嚴重器質性疾病，包括癌癥、冠心病、心肌梗死或腦卒中；傳染病，包括肺結核和艾滋?。恍锞?；計劃懷

孕、懷孕或哺乳。解

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牌研究對象納入排除標準——以II型糖尿病研究為例Doi:10.1038/s41579-018-0029-9解

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牌iHMP——描述腸道微生態系統診斷和治療炎癥性腸?。簶颖臼占z測和數據生成流程從每個病人，收集了三種不同類型的樣本：不同時間點糞便樣本、定期活檢組織和定期的血液樣本。活檢按臨床指示采集，在臨床檢查中采集血液，糞便樣本由參與者自行在家采集。多組學數據生成(主要是基于核苷酸序列和質譜)提供微生物、宿主和混合圖譜，包括16S

rRNA基因檢測、整個Metagenome和Metatranscriptome

shotgun序列、代謝物和蛋白質譜、單細胞分析、全病毒shotgun序列和血清學圖譜。每個樣本還附有臨床(血液/活檢)或環境、飲食問卷調查(糞便)

數據。解

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牌iHMP——2型糖尿病患者呼吸和其他應激狀態下微生物和宿主的變化：樣本收集、檢測和數據生成流程在每次就診時從每位患者收集血樣和微生物組樣品（包括鼻拭子、糞便和尿樣）。

多組學數據生成（主要但不完全是基于核苷酸序列和質譜的）將提供微生物系統發育組成，宏基因組，宏轉錄組和宏蛋白質組的概況;

宿主蛋白質譜，細胞因子和自身抗體，以及全代謝組譜。

每個樣本還收集臨床（血液）或問卷調查的壓力水平，環境和飲食（糞便和尿液）數據。解

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牌人體微生態與免疫的因果和機制研究doi:10.1126/sciimmunol.aao1603在宿主-菌群互作中證明因果性菌群影響人體免疫性疾病的可能機制常見研究思路及案例詳解02解

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牌人體微生態常見四種研究方案菌株水平（

strain-specific

）類似于GWAS分析，用多元統計學方法可以對腸道菌群種類組成、功能基因組成和宿主代謝表型的變化進行關聯分析，目的是鑒定與疾病、表型相關的微生物物種、基因或代謝物質等。

該方法可以預測微生物組和疾病狀態的關系。全微生物組關聯分析（MWAS）可從物種、基因等水平探討發病機制，可提供早期預警，在一定程度上為臨床醫生提供了輔助診斷的依據。生物標記物（biomarkers）微生物多樣性、宏基因組、宏轉錄組三者結合可以在群落水平、DNA和mRNA水平上同時進行研究，實現多重角度互相驗證，全面解析微生物環境群落。多組學研究（multi-omics）只有在菌株水平說明致病性機制才能

從復雜的因素中得到確切的對應關系。包含兩層含義：①用單個菌株來研究

與疾病的關系，②致病性分析達到菌

株水平。發掘微生物與表型性狀的關聯性深入研究導致致病性的物種發掘潛在的基因或物種全面解析微生物群落功能CBAD解

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牌A.

生物標志物挖掘微生物生物標志物應用于精準醫學，進行預測免疫治療效果生物標志物的篩選，提供具有最大化臨床效益的治療方案進行微生物群落結構、功能和代謝產物與健康/疾病狀況/結果的關聯研究解

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研成

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牌A.

生物標志物挖掘-案例1Multi-cohort

analysisofcolorectal

cancer

metagenome

identified

altered

bacteria

across

populations

and

universal

bacterial

markers結直腸癌宏基因組的多隊列分析鑒定出在不同群體中改變的細菌和通用細菌標志物實驗對象：中、美、澳、德法255位結直腸癌患者和271健康對照實驗方法：糞便微生物宏基因組測序實驗平臺：Illumina

HiSeq

2000/2500主要結果：Meta分析共鑒定出結直腸癌糞便微生物中富集的7種細菌：脆弱擬桿菌、具核梭桿菌、不解糖卟啉單胞菌、微小小單胞菌、中間普雷沃菌、芬氏別樣桿菌、食氨基酸熱厭氧弧菌；以上7種細菌作為標志物可有效區分不同人群中結直腸癌患者和健康對照，

接收者操作特征曲線AUC為0.80（并入臨床信息后AUC為0.88）；豐度相關性分析結果表明，結直腸癌富集、減少的細菌形成各自的共生網絡；結直腸癌富集細菌與脂多糖、能量的生物合成途徑相關IF：9.133解

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牌Commensal

Bifidobacterium

promotes

antitumor

immunity

and

facilitates

anti–PD-L1

efficacy共生雙歧桿菌促進宿主抗腫瘤免疫反應及抗PD-L1療效實驗對象：黑色素瘤小鼠模型實驗方法：微生物多樣性測序，16SrDNA

V4-V5實驗平臺：Illumina

MiSeq主要結果：具有不同共生菌群患黑色素瘤小鼠體內存在自發抗腫瘤免疫反應的差異，且這些差異在共同喂養或菌群移植后得到消除；16S

rRNA基因測序結果表明雙歧桿菌與抗腫瘤作用相關；單獨口服雙歧桿菌可將腫瘤控制至與PD-L1特異性抗體療法下相同的程度，并且二者組合治療幾乎消除了腫瘤生長；增強的樹突細胞功能導致的腫瘤微環境中增強的CD8

+

T細胞的致敏和積累介導了該作用；結果表明，微生物群落的調控可能會調節癌癥免疫療效A.

生物標志物挖掘-案例2知

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牌B.

菌株水平、代謝疾病多組學研究方案Zhang

C.,

et.al.

Genome

medicine.2016.樣本收集糞便樣本宏基因組血液收集臨床表型尿液、血漿、糞懸液宏代謝組高深度測序、de

novo拼接組裝基因豐度共豐度基因聚類基因組變異分析樣本分析LC,LC-MS,GC-MS,NMR鑒定與疾病相關的代謝物質代謝物質和新陳代謝通路變化生理學狀態：血糖內穩態FBS,FBI,OGTT,ITT體液內穩態TE,HDL,LDL,TC炎癥因子TNF-α,IL-1β,IL-6，IL-10宿主新陳代謝內穩態、免疫解

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動陪物伴模醫型生中科驗研證成

長細菌基因組與代謝物質/表型相關性的統計分析鑒定特定基因組中功能基因樣本收集與提取解

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牌案例-膳食纖維選擇性富集的腸道細菌可緩解2型糖尿病簽署知情同意書個人信息的問卷調查HbA1c和快速血糖的篩選檢測空腹靜脈血液樣本糞便樣本尿液樣本膳食耐量試驗人體測量以膳食為基礎的進食頻率問卷24-h飲食記錄受試者

53名 資格篩查4名

放棄3名

不符合納入標準1名

需進一步篩選49名受試者 受試者

53名 資格篩查受試者

32名

接受阿卡波 受試者

17名

接受阿卡波糖和WTP飲食 糖和常規治療5名

放棄2名

不良事件 1名

放棄2名

違反協議 1名

生病1名

退出27名

完成實驗 16名

完成實驗納入數據集 納入數據集Gut

bacteria

selectively

promoted

by

dietary

fibers

alleviate

type

2diabetes實驗設計高膳食纖維飲食基于2013年中國糖尿病學會T2DM指南進行患者教育和飲食建議解

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牌高膳食纖維飲食改善2型糖尿病患者的血糖、體重、血脂及腸道微生物群落結構糖化血紅蛋白比例（衡量血糖總體控制情況的指標），

在起初都會出現明顯下降，但從28天以后，W組的下降

水平會更加顯著。糖化血紅蛋白達標的患者比例，W組也明顯高于U組（89%

vs

50%），此外W組的其他血糖指標、體重和血脂情況的改善也更好?？崭寡?，W組干預初期下降速水平更加顯著。餐后血糖，W組干預初期下降速水平更加顯著。在起初的28天，腸道菌群基因的豐富度明顯下降（許多研究指出，菌群基因的高多樣性通常預示著較高的健康狀況），在28天后，W組的基因豐富度明顯高于U組；并且在干預結束時的84天，兩組的腸道菌群結構存在明顯差異。解

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牌高纖維飲食改變2型糖尿病患者腸道細菌對碳水化合物的發酵CAZy家族基因豐度乙酸產生酶編碼基因丁酸產生酶編碼基因乙酸丁酸胰高血糖素樣肽-1解

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牌膳食纖維飲食精確“釣”出15株緩解2型糖尿病的細菌79個菌株在高膳食纖維飲食后沒有變化，47個發生顯著降低，而還有15個菌株被富集，并在28天時達到最大。這15個菌株主要來源于三個門，在W組，15個菌株均可產生乙酸，其中5個還能產生丁酸，而在U

組，15個菌株中僅有3個可產生乙酸生的科菌研株成顯長著增加，提示這15個菌株是高膳食纖維改善代謝的主要貢獻者。解

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牌腸道菌群在基因水平上的變化降解碳水化合物(A)的基因的豐度，可以更好地反映與患者健康相關的菌群變化。干預后，參與淀粉(C)和菊粉(D)分解的基因在兩組受試者腸道中均顯著增加，

而參與利用果膠質(E)和黏液素(F)

的

基

因

則

均

顯

著

減

少

。比較W組與U組發現，編碼用于分解植物細胞壁多酶復合體銜接(G)和錨定部分的基因(H)僅在W

組干預后增加。解

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牌腸道菌群變化與改善2型糖尿病之間的“因果關聯”：小鼠糞菌移植前后生理指標、菌群比較空腹血糖胰島素口腔葡萄糖耐受測試 體重解

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牌Wang

J.,et.al.

Nature

Reviews

Microbiology.

2016.C.

MWAS（宏基因組關聯分析）技術方案研究群體選擇 樣本取樣宏基因組測序功能基因注釋共豐度Genome

binning鑒定與疾病相關的因子驗證：統計+實驗實驗對象：類風濕關節炎患者、健康對照糞便、牙齒及唾液樣品實驗方法：宏基因組測序實驗平臺：Illumina

HiSeq

PE100主要結果：腸道、口腔微生物組間存在一致性，表明不同身體部位物種豐度和功能存在重疊；類風濕性關節炎患者腸道、口腔菌群失調，治療后可部分恢復；區別于健康對照，RA患者腸道、牙齒或唾液微生物組的改變與臨床指標相關，因此可據其對治療的響應用于個體分層；嗜血桿菌于RA患者中缺乏，且與血清自身抗體水平呈負相關；RA患者唾液乳桿菌的豐度增加，特別是RA病情非?；钴S時；RA患者微生物群鐵、硫、鋅和精氨酸的氧化還原環境、轉運和代謝相關功能發生改變；同時檢測到菌群對RA相關抗原的分子模擬解

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牌案例-MWAS研究中國人群類風濕性關節炎The

oral

andgut

microbiomesare

perturbed

inrheumatoid

arthritis

and

partly

normalized

aftertreatment類風濕性關節炎患者口腔和腸道微生物組失調且治療后得到部分恢復212份

糞便樣本77名

未治療

VS

80名

對照17名

未治療

VS

17名

親屬21名

DMARD-治療98份

唾液樣本51名

未治療47名

對照宏基因組測序分類學注釋

物種豐度分析全基因組相關分析（MGWAS）KEGG功能分析105份

牙齒樣本54名

未治療51名

對照解

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陪伴

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牌KEGG功能分析病人三個部位（腸道，牙齒及唾液）菌群失衡情況RA患者脂多糖生物合成等相關KEGG模塊相對富集；RA患者乙酰輔酶A還原途徑相對富集；與健康對照相比，RA患者腸道菌群失調解

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牌RA患者及健康對照口腔（齒齦和唾液）中基因連鎖群（MLG）網絡圖RA患者與健康對照齒齦富集MLGs RA患者與健康對照唾液富集MLGs通過RA患者于對照口腔樣本MLGs分析，得到RA中富集的MLGs、微生物分類群；盡管口腔微生物受到飲食、口腔衛生等因素影響，但是RA患者口腔微生物組與健康對照相比有所偏離解

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牌腸道菌群與口腔微生物關系基因連鎖群（MLG）網絡圖腸道與牙齒MLGs相關分析腸道與唾液MLGs相關分析RA患者口腔、腸道等不同位點細菌存在共變化趨勢解

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牌糞便與口腔（齒齦、唾液）基因連鎖群（MLG）對RA預測牙齒樣本唾液樣本糞便樣本AUC：糞便樣本0.94牙齒樣本0.87唾液樣本0.81解

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牌D.

多組學技術方案環境微生物樣本16S/18S/ITS測序物