免疫細胞和組織化學技術第一節 概述免疫細胞和組織化學技術又稱免疫細胞化學，習慣簡稱為免疫組化，是指用標記的特異性抗體(或抗原)在組織細胞原位通過抗原抗體反應，對相應抗原(或抗體)以及其他物質進行定性、定位、定量測定的一項新技術。基本原理免疫組化技術利用抗原與抗體特異性結合的特點免疫組化技術利用抗原與抗體特異性結合的特點或半抗原注入另一種動物體內，使之產生與該抗原相應的特異性抗體;將抗體從動物血清中提出，結合上某種標記物，即成為標記抗體。用標記抗體與組織切片標本孵育(染色)，抗體則與細胞中相應抗原發生特異性結合，結合部位被標記物顯示，借助顯微鏡(包括電子顯微鏡)可以觀察到該物質的分布、含量。組織或細胞內凡是能作為抗原或半抗原的物質都可用免疫組化的方法進行檢測，如多肽、蛋白質、受體、多糖、酶、激素、病原體等。第二節免疫熒光組織化學技術免疫熒光組織化學技術是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光標記物與細胞或組織內的相應抗原(或抗體)起反應。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光，從而確定抗原或抗體的性質、位置，并可以利用定量技術測定其含量。用熒光抗體檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標記物檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。免疫熒光組化技術染色方法分為：直接法、間接法、補體法和雙重熒光標記法。是免疫熒光組化技術最簡單和基本的方法。把熒光抗體(或抗原)滴加于待檢標本片上，直接與細胞或組織中相應抗原(或抗體)結合，洗滌后在熒光顯微鏡下即可見抗原(或抗體)存在部位呈現特異性熒光(圖1)。此法常用于細菌、病毒等的快速檢查和淋巴細胞表面抗原與受體的鑒定。直接法間接法用已知抗體檢測未知抗原時，先用特異性抗體(第一抗體，簡稱“一抗”)與相應抗原結合，再用熒光素標記的抗特異性抗體(第二抗體，簡稱“二抗”)與特異性抗體結合，在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應部位呈現明亮的特異性熒光(圖2)。補體法(一)直接檢查組織內免疫復合物法將抗補體C3的熒光抗體與組織切片中結合在抗原抗體復合物上的補體反應，形成抗原抗體補體復合物抗補體熒光抗體復合物，在熒光顯微鏡下呈現陽性熒光的部位就是免疫復合物的存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等(圖3)。(二)間接檢查組織內抗原法將新鮮補體與第一抗體的混合液加在抗原標本切片上，經37℃孵育后，如發生抗原抗體反應，補體就結合在抗原抗體復合物上，再用熒光素標記的抗補體抗體與結合的補體反應，形成抗原—抗體—補體—抗補體熒光抗體的復合物。此法的優點是只需一種熒光抗體即可適用于各種不同種屬來源的第一抗體。第三節免疫酶組織化學技術免疫酶組化技術是通過運用抗原抗體特異性反應，借助酶組織細胞化學的手段，檢測抗原或抗體在組織細胞內存在部位的一門新技術。其基本原理是預先將抗體與酶聯結，制成酶標抗體，再利用酶對底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，然后借助光鏡或電鏡進行觀察，以對細胞內或細胞表面的抗原或抗體進行定位。本方法敏感性高，染色標本可以長時間保存，已成為免疫組化最常用的方法之一。直接法

基本原理是將酶標記的特異性抗體直接與待檢測組織細胞內的特定抗原結合，再通過與酶的底物作用生成有色的不溶性產物，沉積在抗原抗體反應部位，從而對抗原進行定性、定位以及定量研究。直接法具有操作簡便、快速、特異性強、非特異性背景反應低等優點，常應用于檢查腎活檢標本中的抗體或補體成分，亦用于系統性紅斑狼瘡等結締組織疾病的檢查。間接法基本原理是先用特異性抗體(一抗)與組織中的抗原反應，再用酶標記的抗特異性抗體(二抗)與一抗反應，形成抗原—抗體—酶標抗抗體復合物，最后通過酶的底物顯色。因為對于同一種屬動物不同種類的第一抗體，只要用一種酶標抗抗體就能顯示不同特異性抗原的存在。因此，間接法與直接法相比更具有實用性，在酶標抗體染色中最為常用。PAP法基本原理是特異性抗體(一抗)與組織中的抗原結合后，將橋抗體(二抗)結合其上，橋抗體再與酶及其抗體制成的復合物(PAP)連接起來，最后經過底物的呈色反應將抗原顯示出來。雙橋PAP法該法是PAP法的改良，操作與單橋法基本相似，所不同的是切片經單橋PAP復合物孵育后，漂洗，再孵育橋抗體和PAP復合物(均可稀釋1倍)，即切片經兩次橋抗體、兩次PAP孵育。雙橋法可結合更多的PAP于抗原分子上，從而使敏感性增強，對于組織細胞中微量抗原的檢測具有實用價值。第四節親和免疫組織化學技術

親和免疫組化技術是利用兩種物質之間的高度親和特性，將酶、熒光素等標記物與親和物質連接，對抗原或其他靶物質進行定位和定量的方法。ABC技術其原理是先將生物素與HRP結合，形成生物素化的HRP，再與卵白素按一定比例混合，即形成ABC復合物。然后將生物素化的二抗與特異性一抗結合，再與ABC復合物連接，形成抗原—特異性抗體—生物素化二抗—ABC復合物，最后進行顯色反應定位。SP法SP法又稱為標記的鏈霉卵白素—生物素(LSAB)法。其染色原理和操作步驟與ABC法相同，只是用鏈霉菌抗生物素蛋白代替了ABC復合物中的抗生物素，即將生物素化的HRP和鏈霉菌抗生物素蛋白混合，形成SP復合物，再用生物素化的二抗將特異性一抗和SP復合物連接起來，最后用底物顯色劑顯色，從而顯示抗原的位置。SPA法SPA能與某些哺乳動物IgG的Fc段非特異性結合，也能與人的IgG1、IgG2和IgG4結合。另一方面，酶、熒光素、膠體金等可以標記在SPA上，使之成為免疫組化中有用的工具。如SPA可用在PAP法中代替橋抗體;標記SPA可直接檢測組織細胞內的IgG成分或免疫復合物。而且，它具有操作簡便、染色時間短、靈敏度高和背景著色淺的優點。第五節免疫組化染色中常見問題及其處理一、組織處理組織標本的取材和固定是否及時是防止組織自溶和抗原丟失的關鍵，也是做好免疫組化染色的第一步。取材

離體組織取材最好在2小時內。取材時，要一刀切開組織，以減少對組織的擠壓。組織塊大小、厚度要適中，厚度一般不要超過0.2cm，以利于組織的均勻固定。2.固定用于免疫組化的固定劑很多，最好根據抗原的耐受性選擇相應的固定液，但在臨床病理的實際工作中，通常是在常規HE染色后決定是否進行免疫組化染色，固定劑一般都是用4%甲醛液，此時，固定時間最好在12小時以內，否則，隨固定時間的延長，組織抗原的檢出率會逐漸下降。另外，組織固定后要充分沖洗，去除固定劑，以免固定劑對染色造成影響。3.脫水、透明、浸蠟

脫水、透明要充分，浸蠟的時間和溫度需嚴格控制，不能過度，否則既影響抗原定位的準確性，又因組織硬、脆而致切片不完整，染色時容易脫片。一般組織塊無水乙醇脫水共3步，每步1小時;二甲苯透明15～30分鐘;浸蠟及包埋用石蠟溫度不超過60℃，常用低熔點的軟蠟包埋。二、制片(一)載物片的處理在免疫組化染色中，如果載物片沒有處理好，很容易發生脫片。可以根據情況，選擇下列一種方法預先處理載物片。1.多聚左旋賴氨酸2.明膠硫酸鉻鉀法3.氨丙基—乙氧基甲硅烷(APES)法(二)切片切片刀要鋒利，切成的切片要完整，應無皺褶、無刀痕，否則，染色時可出現假陽性。切片厚度一般在3～5μm，太厚會影響對染色結果的判斷，染色時還容易發生脫片。三、染色在免疫組化染色過程中，要注意以下幾方面的問題。(一)去除內源性酶及內源性生物素1.去除內源性2.去除內源性3.滅活堿性磷酸酶(二)抑制非特異性背景著色非特異性背景著色最常見的情況是抗體吸附到組織中高度荷電的膠原和結締組織上。為了防止這種情況的發生，最好的辦法是用特異性抗體來源的同種動物滅活的非免疫血清在特異性抗體之前進行處理，以封閉荷電點，阻止一抗與之結合。但一般實驗室常用的是2%～10%羊血清或2%牛血清白蛋白，在室溫下作用10～30分鐘。須注意此種結合是不牢固的，所以不要沖洗，傾去余液后直接加一抗。使用多克隆抗體，更易產生背景著色，在稀釋抗體時可使用含1%非免疫血清的pH為7.4的PBS液。沖洗

3分鐘，2次。(三)緩沖液抗原抗體反應最合適的pH為7.2～7.6。免疫組化最常用的緩沖液是0.01mol/LpH為7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)，其簡易配制方法為:將NaH2PO41g、Na2HPO415.6g、NaCl42.5g分別加入5000ml蒸餾水中即成。若采用AKP作為標記物底物，用0.02mol/LpH為8.2的TBS緩沖液較好。(四)抗原修復甲醛在固定組織時會封閉部分抗原決定簇，因此，在染色時，有些抗原需要先進行修復或暴露，以利抗原抗體最大限度地結合，增強特異性染色。目前常用的抗原修復方法有以下幾種。胰蛋白酶法2.胃蛋白酶法3.熱誘導的抗原修復(HIAR(1)水浴加熱法(2)微波加熱法(3)高壓加熱法。(五)抗體的選用、分裝、稀釋及保存抗體是免疫組化技術中最重要的試劑。使用新的抗體前，應該了解其工作濃度范圍，還應根據實驗室的條件，確定最佳稀釋度，以獲得最強的特異性染色和最弱的背景染色。另外，還要注意抗體的保存，防止抗體的效價過快地降低。抗體的選用多克隆抗體的抗原專一性較差，非特異性反應較明顯，

但其價格低廉，效價較高，

稀釋度一般在(1：100)～

(1：1000)，適應性強。

單克隆抗體的抗原專一性強，

質量和效價穩定，非特異性反應較少，

但其價格昂貴，效價較低，

稀釋度一般在(1：50)～(1：100)。2.抗體稀釋抗原抗體的結合反應與兩者之間的分子比例有密切的關系，如果抗體分子過多，陽性反應反而減弱，甚至呈假陽性。因此選擇適當的抗體稀釋度，不僅能節省抗體，而且還可以獲得滿意的染色效果。（1）影響抗體稀釋度的因素:①抗體的濃度(滴度)：抗體的濃度越高，稀釋度就越高。②抗體溶液中非特異性蛋白的含量：非特異性蛋白也能吸附在組織結構上，引起背景的非特異性染色。因此，宜選用效價高、稀釋度高的抗體，以減低背景染色。③孵育時間：如適當延長孵育時間，抗體的稀釋度可相應提高。④染色方法：免疫組化染色方法的靈敏度高，所用抗體的稀釋度也可隨之提高。（2）抗體最佳稀釋度的測定方法1）直接測定法2)棋盤測定法3)抗體稀釋液的配制3.抗體的分裝和保存(六)孵育方法及時間抗體孵育應在特制的濕盒內進行，以免切片因水分蒸發、干燥而導致染色失敗。孵育時間常為1小時左右，孵育溫度為室溫或37℃。可根據抗體的效價和檢測方法的靈敏度進行適當的延長或縮短，延長孵育時間可在4℃冰箱過夜。近年來，由于微波技術在免疫組化染色中的應用，使得抗體孵育時間大為縮短，提高了檢測速度。(七)顯色顯色是免疫組化染色最后的關鍵步驟。一般地，HRP的顯色采用DAB或AEC顯色系統。免疫組化常用的顯色劑有以下兩種。1.3，3'二氨基聯苯胺(DAB2.3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)四、其他常見問題(一)對照試驗的設置常設的對照如下。1.空白對照第一抗體由PBS取代，結果應為陰性。2.陰性對照用已知抗原陰性的標本與待檢標本同時染色，結果應為陰性。3.陽性對照用已知含有待檢測抗原的切片與待檢標本同樣處理，做免疫組化染色，結果應為陽性，稱為陽性對照。4.吸收試驗陰性對照用過量的已知相應的純化抗原與第一抗體反應，抗體結合位點全部被抗原結合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內的抗原發生反應，用其做免疫組化染色，結果應為陰性。此種對照因抗原來之不易，較少使用。5.替代對照用一抗動物免疫前血清或同種動物與待測抗原無關的抗體替代一抗，結果應為陰性。6.自身對照在同一切片上，將不同組織成分中的陽性或陰性結果與檢測目的物進行對照比較，如actin、CD34在正常組織中的血管壁肌層應為陽性；desmin可以與血管壁及肌束對照等。如果應為陽性的組織是陽性，表明免疫組化技術正確，如為陰性，則表明染色技術有問題或免疫試劑質量有問題。(二)結果的判斷免疫組化結果的判斷尚無統一標準，一般有兩種方法:一種方法是以檢測結果陽性細胞指數來定性，即以一個視野中的陽性細胞數與總細胞數的百分比，再取10個相同視野算得平均指數。第二種方法是以染色陽性強度和陽性檢出率相結合而定，一般地，陽性細胞數少于25為陰性，25～50為+，50～75為+