ICS65.020.20CCSB0521IDB21/T3717—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由遼寧省農業農村廳提出并歸口管理。本文件起草單位：遼寧省果樹科學研究所。本文件主要起草人：劉碩、劉寧、劉威生、章秋平、張玉萍、馬小雪、張玉君、徐銘、趙海娟、劉家成。本文件發布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復并認真處理，根據實際情況依法進行評估及復審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農業農村廳（沈陽市和平區太原北街2號聯系電話文件起草單位通訊地址：遼寧省果樹科學研究所（遼寧省營口市鲅魚圈區熊岳鎮鐵東街聯系電話1DB21/T3717—2023李、杏品種鑒定SSR分子標記法本文件規定了利用簡單重復序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子標記法進行李（Plum）、杏（Apricot）品種鑒定的主要儀器設備與試劑耗材、試劑配制、參照種質、操作步驟、基因型對比、結果判定等要求。本文件適用于利用SSR分子標記指紋對比快速鑒定李、杏種質資源。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19557.1植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南總則GB/T19557.30植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南梨GB/T30988多酚類植物基因組DNA提取純化及測試方法GB/T30989-2014高通量基因測序技術規程GB/T37870個體鑒定的高通量測序方法NY/T2594植物品種鑒定DNA分子標記法總則3術語和定義NY/T2594界定的術語和定義適用于本文件。4縮略語下列縮略語適用于本文件。bp:堿基對（Basepair）CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammoniumammoniumbromide）ddH2O：重蒸餾水（Distilledanddeionizedwater）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）Hi-Di：去離子甲酰胺（Highlydeionizedformamide）nt：堿基（Nucleotide）PCR：多聚酶鏈式反應（Polymerasechainreaction）PVP：聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone）TE：Tris-EDTA緩沖液（10mMTris，1mMEDTA，pH8.0）5原理2DB21/T3717—2023李、杏的不同種質資源，其基因組存在著能夠進行穩定遺傳的簡單重復序列SSR的重復次數差異。這種差異可以通過從抽取具有代表性的檢測樣品種提取DNA，利用SSR引物進行擴增和電泳，通過檢測其擴增產物片段大小加以區分。6主要儀器設備與試劑耗材高速離心機、分光光度計等主要儀器設備，氯仿、異戊醇等試劑，移液槍配套槍頭、槍頭盒等耗材，具體見附錄A。7試劑配制試劑配制方法見附錄B。用于李、杏品種鑒定的優異SSR引物有45對，見附錄C。退火溫度55℃-57℃。9參照品種參照品種見附錄D。10操作步驟10.1樣品準備受檢及參照李、杏品種樣品均采集幼嫩葉片，按照GB/T30988-2014，8提取步驟改良。每份待測品種和參照品種選取3個單株進行混合分析。于春季分別自每個樣株上采集新鮮、幼嫩、健康的葉片兩片（約1g）混合置于離心管，做好標記置于液氮中浸泡后，保存于-80℃冰箱。10.2DNA提取采用改良CTAB法提取李、杏樣品DNA；或利用植物基因組DNA提取試劑盒依照說明書進行提取。在通風環境或通風櫥進行提取。改良CTAB法DNA提取步驟如下：a)將液氮冷凍后的葉片樣品放入研缽中磨成粉末，然后迅速將0.2g左右粉末轉入2mL離心管中，加入65℃預熱的CTAB提取液600μL加入適量PVP粉末或1%的β-巰基乙醇溶液充分混勻1min后置于65℃水浴鍋中50min，每隔5min搖蕩1次；b)取出離心管置于冰上10min，然后置于4℃高速離心機中，12000rpm離心15min。使用移液槍取上清液至新1.5mL離心管中；c)加入20μg/μLRNA消化酶10μL并搖晃均勻，隨后置于37℃培養箱消化60min；d)取出離心管加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1）后，充分混勻，室溫下靜置10min，離心機12000rpm離心15min；3DB21/T3717—2023e)取上清液500μL置于新的1.5mL離心管中。加入1.0mL的-20℃冰乙醇溶液，輕輕搖晃，置于-20℃冰箱60min或4℃過夜；f)取出離心管并置于4℃高速離心機中，12000rpm離心30min，棄上清，利用75%乙醇洗滌沉淀兩次，管口向下置于室溫下自然晾干；g)加入100μLTE溶液溶解DNA沉淀，待完全溶解后利用核酸測定儀檢測DNA濃度和純度，將DNA濃度稀釋至20ng/μL，置于-20℃冰箱保存。注：其他所獲DNA質量能夠滿足后續PCR擴增需要的DNA提取10.3PCR擴增10.3.1PCR反應體系10.3.2PCR反應程序PCR反應程序如下：a)95℃變性5min；b)95℃變性30s；c)依照附錄C推薦的引物退火溫度退火30s；d)72℃延伸45s；e)重復b-d步驟35個循環；f)72℃延伸10min；g)PCR產物置于4℃保存。10.4PCR擴增產物檢測10.4.1PCR產物純化將PCR擴增產物置于96孔PCR板進行純化操作，步驟如下：a)20μLPCR產物加入5μL5M的NaCl（終濃度0.5M）；b)加入25μL24％的PEG8000溶液（終濃度12混勻；c)置于室溫30min；d)置于離心機4500xg，4℃離心30min后，立即將板反扣在厚的吸水紙上，離心至150xg，去除上清；e)加入70μL75％乙醇，4500g，4℃離心15min，立即將板反扣在厚的吸水紙上，離心至150g，去除上清，重復一次；f)50℃或室溫干燥，加入10μLddH2O溶解，即為純化的PCR產物。10.4.2毛細管電泳上機樣品制備4DB21/T3717—2023毛細管電泳上機樣品制備，步驟如下：a)每份純化后的PCR產物取1μL于新的96孔PCR板中，每份樣品加入0.5μL內標（GS500LIZ）及50μL的Hi-Di稀釋液，劇烈震蕩5min，使內標充分混勻；b)將96孔平板放入PCR儀中，95℃加熱5min，程序結束后迅速放在冰上冷卻2min。做好上機表后，在ABI3730DNA測序儀進行檢測。11基因型對比每個樣品SSR位點的等位變異以擴增產物峰值大小的形式表示。使用Genemapper4.0軟件讀取ABI3730檢測的等位基因峰圖（圖1，圖2，圖3依照軟件說明書整理每對引物在每份品種中擴增產物峰值的保留時間并記錄在EXCEL表格中，匯成基因型矩陣。根據待測品種與參照品種的SSR等位基因長度、位點和與雜合特性，確定是否有差異。圖1三種杏品種4種熒光SSR引物檢測峰圖5DB21/T3717—2023圖2SSR引物‘ampa101’（編號4）等位基因峰圖圖3SSR引物ssrpacita5（編號110）等位基因峰圖12結果判定12.1判定方法當品種間差異位點數≥2時，判定為不同品種；當品種間差異位點數＜2時，判定為疑同品種。注：必要時，可按照GB/T19557.1和GB/T19557.30給出的原則進行田間測12.2結果表述待測樣品與對照樣品（或數據庫中已知品種）利用分子標記類型，采用 檢測平臺，采用位點組合進行檢測，結果顯示：檢測位點數為，差異位點數為，判定為（相同或疑同）。7DB21/T3717—2023主要儀器設備與試劑、耗材主要儀器設備與試劑、耗材見表A.1。表A.1主要儀器設備與試劑、耗材高速離心機、分光光度計、移液器、水浴鍋、天平、磁8DB21/T3717—2023試劑配制方法B.1DNA提取試劑的配置B.1.11.0MTris-HCL溶液（pH=8.0）稱量121.1gTris置于1L燒杯中，加入約800ml的ddH2O，充分攪拌溶解，用濃鹽酸調節pH值至8.0（約加入42mL的濃鹽酸）。將溶液定容至1L，高溫高壓滅菌后，室溫保存。B.1.20.5MEDTA溶液（pH=8.0）稱取186.1gNa2EDTA?2H2O，置于1L燒杯中；加入約800mL的ddH2O，充分攪拌；用NaOH調節pH值至8.0（約20gNaOH)；加ddH2O將溶液定容至1L；高溫高壓滅菌，室溫保存。B.1.32%CTAB溶液分別稱取CTAB20g，NaCl81.816g，PVP20g，分別量取1MTris-HCl溶液（pH=8.0）100mL，0.5MEDTA溶液（pH=8.0）40mL，定容至1000mL。B.1.4氯仿—異戊醇（24:1）分別量取240mL氯仿和10mL異戊醇，將兩者混勻。B.1.575%乙醇溶液量取150mL無水乙醇，50mLddH2O置于燒杯中，充分混勻。9DB21/T3717—2023 SSR引物見表C.1。表C.1SSR引物13253 4554627482941162 -1175-6154812424DB21/T3717—2023表C.1SSR引物(續)6-15-1411181-12DB21/T3717—2023參照品種李參照品種見表D.1。表D.1李參照品種1P.salicinaLindl.2P.salicinaLindl.3P.salicinaLindl.4P.salicinaLindl.5P.salicinaLindl.6P.salicinaLindl.7P.salicinaLindl.8P.salicinaLindl.9P.salicinaLindl.P.salicinaLindl.P.salicinaLindl.P.salicinaLindl.P.salicinaLindl.P.salicinaLindl.P.salicinaLindl.P.salicinaLindl.P.salicinaLindl.P.salicinaLindl.P.salicinaLindl.DB21/T3717—2023杏參照品種見表D.2。表D.2杏參照品種1P.armeniacaL.2P.armenia